溶瘤病毒——困难与挑战
传播和渗透
在癌症中，上皮细胞的细胞内连接是高分子量治疗剂渗透的屏障，会引发耐药性。此外，在转移过程中，上皮-间充质转化和间充质-上皮转化，表型发生改变，使上皮连接紧密，给治疗带来困难。上皮连接也是一种屏障，阻止OV，尤其是腺病毒的细胞内渗透。一些腺病毒，包括HAdV-B3、B14和B14p，可能在感染早期和细胞分裂前通过释放戊二烯十二面体（Pt-Dd）来克服连接，而不产生Pt-Dd的腺病毒会在同一阶段产生大量的纤维蛋白。但是，HAdV-C5仍然是构建溶瘤腺病毒最常用的血清型，并且不释放Pt-Dd。Yumul等人改良的Ad5Δ24可产生上皮连接开放剂（JO），与未修饰的病毒相比，表达JO的溶瘤Ad具有更强的抗肿瘤作用；联合应用JO和未经修饰的溶瘤腺病毒比单独注射病毒更能抑制肿瘤生长。JO是一种含有自二聚重组蛋白的HAdV-B3纤维球，其中纤维球的C端被改造以增加其与桥粒糖蛋白2（DSG2）的亲和力。DSG2是参与细胞间连接的钙粘蛋白家族成员，在上皮性肿瘤中过度表达。JO与DSG2结合后，信号通路激活基质金属蛋白酶ADAM17，引起DSG2胞外区的分裂和上皮细胞的分离。
细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）是由蛋白多糖组成的，能够阻碍瘤内肿瘤因子的扩散。ECM 降解酶如松弛素、基质金属蛋白酶 (MMP)-1、-8、-9、软骨素酶和透明质酸酶与 OV共同给药，或在 GLV-1h255 (VACV) 和 VCN-01 中诱导它们的基因表达 (OAdV) 可以增加 OV 扩散到 TME，并提高 OV在癌症中的治疗效率（图1）。
如上所述，ECM和细胞连接是OV扩散和扩散的主要障碍。除了蛋白酶，癌细胞凋亡也会促进病毒的传播。Nagano等人报道，细胞毒性药物诱导细胞凋亡和caspase-8活化导致肿瘤内渗透增加，从而提高溶瘤HSV的抗肿瘤疗效；他们认为凋亡癌细胞的收缩或去除产生了通道样结构和空隙，促进溶瘤性HSV的扩散。
肿瘤靶向
尽管OV具有基于肿瘤细胞上一些过度表达的受体和粘附分子的肿瘤趋向性，但野生OV的肿瘤趋向性还不够。转基因 OV (Genetically modified OV，GMOV)可以表达对肿瘤相关抗原 (TAA)具有高亲和力的受体（图4）。例如，插入针对人表皮生长因子受体 (HER)-2、上皮细胞粘附分子 (EpCAM) 和癌胚抗原 (CEA) 的单链抗体 (scAb) 可以增加OV对肿瘤的特异性。表达 HIV 衍生糖蛋白 (gp)-160 的 VSV 是一种针对白血病和 T 淋巴瘤的特异性 VSV（图2）。
IFN-I 抗病毒反应的缺陷、肿瘤抑制基因的缺乏，如视网膜母细胞瘤 (Rb) 以及肿瘤细胞中 Ras 信号的增加可引发肿瘤细胞中 OV 的特异性增殖。插入在肿瘤细胞中高表达的肿瘤特异性启动子，如前列腺特异性抗原（PSA）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子，使得肿瘤细胞中得病毒基因特异性表达。一些微小RNA (miRNA) 在健康细胞中过度表达，而它们在肿瘤细胞中的水平可以忽略不计；因此，通过 miRNA 靶向序列 (miRNA-TS) 靶向这些 miRNA 会破坏正常细胞中的病毒 RNA，而肿瘤细胞中miRNA-TS靶标的低表达导致病毒RNA在肿瘤细胞中保留和复制（图4）。
HAdV-C5纤维蛋白与许多其他腺病毒和CAR在靶细胞上的相互作用导致病毒penton碱基蛋白上的RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）基序与宿主细胞整合素的相互作用，这种相互作用诱发网格蛋白介导的内吞作用和病毒进入细胞。由于CAR在许多肿瘤细胞中表达下调，科研人员对其进行了修饰以增强溶瘤性Ad的向肿瘤性，其中一个提高腺病毒感染效率的修饰是在腺病毒纤维旋钮结构域的HI环中插入RGD基序。研究表明，RGD修饰的溶瘤腺病毒治疗CAR阴性肿瘤模型可显著提高感染效率和抗肿瘤活性。另一种针对溶瘤性Ads的策略是使用不同的血清型。Lenman等人发现HAdV-G52能够与靶细胞上的聚唾液酸结合；由于多唾液酸在包括肺和脑在内的癌细胞上的高水平表达，使用HAdV-G52作为OV可以优先感染相应的癌症类型。此外，通过抗体单链可变片段（scfv）与衣壳蛋白IX（pIX）融合或产生纤维嵌合体的抗体靶向也可用于重定向腺病毒。
另一种将病毒靶向肿瘤细胞的策略是使用双特异性接合器，它由两个臂组成，即病毒结合臂和肿瘤细胞结合臂，二者通过化学连接或柔性连接件连接在一起。由于多唾液酸（polySia）在包括肺癌在内的肿瘤细胞上过度表达，Kloos等人设计了一种包含polySia结合单链抗体结构域和CAR外结构域的双特异性转接器，以将溶瘤性Ad重新定位到肺癌，发现用适配器预处理腺病毒载体能有效感染荷瘤小鼠中表达多聚核糖核酸的肿瘤细胞并提高存活率。另一种含有CAR外结构域与CXCL12融合的双特异性转接器，作为CXCR4趋化因子配体，能够增强对趋化因子受体阳性癌细胞的感染性，同时降低肝毒性。Nakano等人还开发了一种由EGFR结合单链抗体和nectin1的N端结构域组成的适配器蛋白，用于将HSV-1定向到EGFR。
免疫反应
使用OV疗法的另一个挑战是由于先前的免疫或感染导致静脉注射后半衰期短而导致的预先存在的免疫力。用聚合物包被溶瘤腺病毒可以在传递过程中保护腺病毒，其中。利用率最高的聚合物是N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺（HPMA）、聚乙烯甘氨酸和聚酰胺胺。除了延长半衰期外，使用聚合物还可通过修饰溶瘤Ad/聚合物来靶向肿瘤。
另一种保护 OV 免受中和抗体的策略是使用细胞载体作为递送载体（图1）。有 3 种主要类型的细胞可用于递送 OV：免疫细胞、转化细胞和祖细胞。除了携带 OV，干细胞还具有定位肿瘤的能力，使之成为有吸引力的载体。在对肿瘤生长至关重要的肿瘤微环境中，各种生长因子、细胞因子、趋化因子和血管生成因子的表达将干细胞吸引到肿瘤部位。例如，在决定干细胞和祖细胞在肿瘤环境中的归巢过程中，缺氧和致瘤因子的上调至关重要；研究表明，溶瘤腺病毒负载神经干细胞（NSC）可增加VEGFR2和CXCR4的表达，从而增加归巢能力；为避免患者发生同种异体移植反应，建议使用自体干细胞。然而，值得注意的是，从接受过多轮治疗的患者身上分离出来的细胞的质量和数量是可变的。
抗病毒细胞因子（包括不同类型 IFN 在内）会阻碍OV复制，进而降低抗肿瘤反应，为了克服这个问题，一些研究使用组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 抑制剂来诱导表观遗传的改变并最大限度地减少肿瘤微环境中的抗病毒细胞因子反应。用丙戊酸钠（VPA，一种HDAC抑制剂）预处理癌细胞可促进溶瘤HSV复制，但是，研究表明，VPA可抑制病毒感染后肿瘤微环境中NK细胞和巨噬细胞的浸润，从而降低抗肿瘤免疫的诱导。此外，HDAC抑制剂还能通过表观遗传修饰使基因表达谱向诱导癌细胞阻滞和凋亡方向转变。
对OV的遗传修饰可以增加细胞因子、趋化因子、共刺激分子、肿瘤细胞外基质 (ECM) 降解酶和抗血管生成分子的表达，增强其抗肿瘤作用（图2、图3）。携带粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 基因的 OV，如 T-VEC、Pexa-Vec 和 CG0070 能够募集抗原呈递细胞 (APC) 和 CTL，从而以最小的抗病毒反应诱导更高效的TAA呈递。表达促炎细胞因子的GMOV具有增强的抗肿瘤效果。在 OV 中插入 IL-12、IL-15、IL-18、TNF-α、IL-24 和 IFN-γ 基因也能够增强抗肿瘤作用，且毒性远低于 IL-2。同时，应用这些细胞因子的非分泌形式仅会引起局部效应，而不会导致全身不良反应。工程化 OV（主要是 VACV）表达的特定趋化因子，如 CCL5、CCL19、CCL20、CCL21，能够增加初始和记忆 T 淋巴细胞和 DC 向 TME 的浸润。同时，在OV中使用一个或多个共刺激配体，包括CD40L、4-1BBL、OX40L和B7-1，例如LOAd703（CD40L和4-1BBL的组合）可以增加抗原呈递和T细胞启动。此外，在 OV 基因组中插入 TLR 配体（如富含 CpG 的区域）能够刺激 TLRs 并进一步激活先天性和获得性免疫。
增强 TME 中免疫反应的另一种方法是消除免疫抑制细胞。表达羟前列腺素脱氢酶 (HPGD) 的 GMOV 使 PGE2 失活并减少 TME 中的MDSC。GMOV表达的可溶性CXCR4作为诱饵受体与肿瘤细胞分泌的CXCL12结合，抑制CXCL12对MDSCs的血管生成、转移和募集的作用。尽管 OV可以通过各种机制释放 TAA，但 GMOV 表达 TAA 或将 TAA 衍生肽包覆在 OV 表面会增加 T 细胞反应并改善 OV治疗。迄今为止，已经研究了大量的 TAA和肽。肽包被相对于肽表达的优势是方便、快速、成本更低，并且在肽包被方法中可以针对每位患者进行个性化。OV 可以被设计以表达促凋亡蛋白，如 TNF 相关的凋亡诱导配体 (TRAIL) 和可诱导肿瘤细胞特异性凋亡的凋亡素；在 OV 中插入小干扰 RNA (siRNAs) 也可以抑制癌基因表达并抑制肿瘤生长。
2',5'-寡腺苷酸合成酶 (OAS)-RNase L系统和 RNA 依赖性蛋白激酶 (PKR)也能够限制病毒感染。在响应病毒感染产生 I 型干扰素后，双链RNA激活 OAS-1、-2、-3 基因的转录，导致 RNase L 激活，最终降解病毒和单链 RNA。除此之外，用双链 RNA 和 I 型 IFN 系统感染细胞会激活PKR。PKR 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可磷酸化真核起始因子2 α (eIF2 α) 的α亚基。eIF2 α 的磷酸化使其处于非活性状态并抑制病毒蛋白的合成。Jha 等人的研究表明，用舒尼替尼（一种 PDGF-R 和 VEGF 抑制剂）进行预处理可增强溶瘤病毒疗法的疗效，对体内外抗病毒酶RNase L和PKR均有抑制作用。此外，贝伐单抗（一种血管内皮生长因子的抑制剂）也可以增加溶瘤腺病毒的扩散，可能是因为贝伐单抗降低了间质液体压力。此外，抗血管生成药物与OV联用具有协同作用，通过抑制血管生成，从而抑制肿瘤生长所必需的氧气和营养物质的供应，增强肿瘤内OV的复制和扩散。
缺氧效应
缺氧是实体瘤的一个特征，发生在肿瘤的发育和生长过程中，会导致细胞周期停滞，可能会影响 Ad和任何其他依赖于细胞周期进程的病毒的复制能力。为了克服缺氧对腺病毒复制的抑制，并利用缺氧条件进行靶向，Clarke等设计了一种溶瘤腺病毒，其中E1A基因的表达由含缺氧反应元件的启动子控制，改良的溶瘤腺病毒获得了在缺氧条件下充分复制的能力。
2009 年的两个课题组（Aghi 等，Fasullo 等）的研究表明缺氧环境增强了溶瘤性 HSV 的病毒复制，这可能与 HSV 对氧细胞减少或氧衍生的自由基诱导的 DNA 损伤（刺激 HSV 复制）的天然趋向性有关。此外，参与 HSV 复制的几个基因的转录被缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）激活。感染 AF2240（一种溶瘤 NDV）使得 HIF-1 α 在缺氧条件下降解，从而导致不同癌细胞系中 HIF-1 α 靶基因的下调。其他病毒（包括水泡性口炎病毒和痘苗病毒）也能够在缺氧条件下增强它们的复制。
OV治疗的生物安全性
除肿瘤细胞外，一些OV也可能在正常细胞中复制并引起损伤。例如，T-VEC可能仍然会导致潜在的感染并引起长期的神经系统不良事件（AE）。使用对人类致病性低的OV，如细小病毒和呼肠孤病毒，通过重复传代削弱OV或删除毒力基因，可以增加OV疗法的安全性。胸苷激酶 (TK) 和受感染细胞蛋白 (ICP)34.5 基因在 VACV 和 HSV-1 复制中起着至关重要的作用，此类基因的产物在肿瘤细胞中含量丰富，因此缺乏这些基因的GMOV可以在肿瘤细胞中复制，而病毒在健康细胞中的复制则由于此类产物的低表达而受损。GL-ONC1 和 Pexa-Vec (JX-594) 是不含 TK的 VACV，T-VEC、HSV-1716 和 G207 是不含 ICP34.5 的 HSV，在临床试验中显示出较好的安全性。野生 ZIKA 病毒在胶质母细胞瘤中具有溶瘤潜力，但也会感染具有严重并发症的正常神经，从其基因组的 3' 去除 10 个核苷酸可以在不降低溶瘤活性的情况下提高安全性。AdV 中 E1 基因的突变或缺失，以及痘病毒中 TK、痘苗生长因子 (VGF)、血凝素和 B18R 基因的缺失会降低正常细胞中 OV 的毒力。然而，删除毒力基因以增加安全性有时会降低 OV 的抗肿瘤活性。
将安全的 OV（如 NDV）与高效的 OV（如 VSV）重组是提高 OV 安全性的另一种方式。重组 VSV-NDV (rVSV-NDV) 包含来自 NDV 的包膜内容和 VSV 的原始骨架。AdV 与危害较小的柯萨奇病毒或细小病毒的重组构成了在不损害正常细胞的情况下在肿瘤细胞感染中具有高效力的 OV；使用埃博拉病毒 (EBOV) 糖蛋白还可降低 rVSV-EBOV 中 VSV 的神经毒性。然而，GMOV 和野生型 OV 的天然同源重组可能会导致转基因和致病性病毒。此外，OV疗法在接受放疗和化疗的免疫受损个体以及孕妇中的安全性仍存在争议。
给药途径
影响OV反应的因素之一是给药方式。肿瘤内注射可精确控制 TME 中的 OV 浓度，从而获得更好的治疗效果，然而，瘤内注射的复杂性限制了给药的重复性。静脉注射因其便利性、可重复性和靶向转移灶的可能性而广受欢迎，但需要肿瘤特异性递送系统并且更有可能引起全身毒性。腹膜内、鞘内/颅内和胸膜内注射分别适用于靶向腹腔内器官、中枢神经系统 (CNS) 和肺部肿瘤，但仅限于在实验室动物中使用。最佳的给药途径仍然是一个争论的问题，没有具体的指导方针。似乎口服/粘膜和鼻腔给药等较不具攻击性的给药途径，至少对胃肠道和脑恶性肿瘤而言，可以提高患者的可接受性，应在未来的研究中加以考虑。
患者选择
哪些患者适合治疗？目前尚未确定可靠的预测性生物标志物，可以预测对溶瘤病毒疗法有反应的患者。另一方面，由于大多数 OV 的实验性质，接受溶瘤病毒治疗的患者通常已经经历了多次常规癌症治疗，他们的免疫系统被破坏，肿瘤与其初始形式相比发生了根本性的改变。Zloza 等人设计了一项研究，测量了黑色素瘤患者在溶瘤痘苗病毒治疗前后外周血单个核细胞基因表达的变化。微阵列数据显示，病毒给药后，分别有 301 和 960 个基因上调和下调。进一步的分析表明，免疫球蛋白样转录物 2 可用作溶瘤痘苗病毒治疗患者的治疗生物标志物；而在另一项研究中，高迁移率组框 1 被建议作为溶瘤腺病毒治疗的预测和预后生物标志物。
图1 规避OV临床试验障碍的策略
（A）促进病毒在肿瘤内的扩散。表达透明质酸酶（HD）的OV能够分解ECM中的HA，增强OV在肿瘤内扩散性。（B）使肿瘤细胞对OV疗法敏感。分泌促凋亡蛋白的OV可逆转肿瘤对OV疗法的耐药性。（C）优化OV转运。载体细胞保护OV免受免疫系统损伤，增强OVs的肿瘤靶向性。（D）OV介导的免疫治疗。OV介导的溶瘤促进免疫系统对肿瘤细胞的反应，提高整体治疗反应。
图2 溶瘤病毒治疗的新方法
图3 细胞因子/趋化因子东武装得溶瘤病毒
图4 OV的遗传修饰
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