免疫评分及肿瘤免疫系统的研究进展
肿瘤通过与周围的微环境密切相互作用（包括肿瘤与免疫系统之间的双向作用）而生长。临床试验表明，适当增强肿瘤的免疫原性能增强患者对治疗的反应并长期获益。除了掌握不同肿瘤分子亚型的适应症外，了解免疫结构的组成有助于指导免疫治疗的联合应用。为了更好地为临床研究提供信息，我们必须首先努力了解肿瘤与免疫系统相互作用的多方面因素，众多不同免疫细胞类型的时空相互作用，以及可能引起新表位出现并推动肿瘤微环境变化的致癌驱动因素和基因突变。而在这其中，免疫评分可以限定肿瘤“不限癌种”疗法的适应性免疫条件，并预测和分层治疗方案的受益因素（尤其是免疫疗法），从而提高临床治疗的准确性。在近日发表于Clinical Cancer Research的一篇综述中，研究人员对免疫评分及其一般特征，并联合分析免疫细胞量化与疾病分子特征及其如何分层肿瘤高复发风险因素进行了讨论。
目前癌症分期主要依据是由美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟（AJCC/UICC）制定的严格依赖于肿瘤TNM分期标准，例如原发肿瘤的范围（T），局部淋巴结的累及（N），以及是否存在远处转移（M）。其他肿瘤细胞参数被用来标识肿瘤的生物学特性和评估手术切除后肿瘤复发的风险。尽管AJCC/UICC分期评估功能强大，但仍无法提供完整的预测信息。相同组织学肿瘤分期的患者，预后可能会有很大差异。TNM分期系统评估预后的方法尽管已经应用很久，但是它不能完整的提供肿瘤细胞以外的预后信息，而且不能提供肿瘤免疫状态的信息，因此可能无法预测对多种治疗方式的反应（图1）。
图1：基于肿瘤细胞特性的癌症分类方法
免疫评分在结肠癌中的应用
越来越多的证据表明，肿瘤的发展在很大程度上取决于其所处的复杂的肿瘤微环境（TME），包括肿瘤细胞及其周围的免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞，血管内皮细胞等。适应性免疫细胞浸润的预后价值优于经典的肿瘤浸润标准，例如核分级、分期和转移状态。我们先前将这些与生存相关的适应性免疫参数定义为“免疫结构”，即适应性免疫细胞在不同肿瘤区域的类型、功能定位、密度和位置。除实质细胞外，TME还包括多种可溶性因子，例如细胞因子，趋化因子和细胞代谢产物。因此，肿瘤的进展和患者的生存反映了肿瘤与宿主免疫系统之间复杂的细胞分子相互作用过程。
在结直肠癌（CRC）中免疫结构中量化适应性免疫细胞为潜在预后标志物的临床方法已建立，即“免疫评分（IS）”。IS对肿瘤核心（CT）和肿瘤浸润交界（IM）的淋巴细胞进行量化，特别是CD3+和CD8+的T细胞，阳性细胞高密度计为1分，密度低为0分，把CD3+和CD8+细胞在CT和IM区域的评分相加，得到总的免疫评分（0~4分），IS与生存期呈正相关。IS对患者无病生存期（DFS）、肿瘤特异性生存率和总生存期（OS）预测价值优于金标准TNM分期，在I~III期CRC中具有统计学意义。
由于IS是T细胞浸润到肿瘤中的直接量度，因此任何直接或间接影响该过程的机制都会影响IS的高低。该机制的核心是肿瘤细胞具有“足够的”免疫原性（引起T细胞介导的免疫反应的能力），这与新抗原负荷有关，并且最常见于高微卫星不稳定性（MSI-H）或错配修复缺陷（dMMR）的患者。实际上，与Lynch综合征相关的CRC（以MSI-H为特征）显示出较高的肿瘤浸润免疫细胞（包括CD3 +和CD8 +）。致癌驱动基因突变可以促使肿瘤免疫原性形成，进而可以间接影响效应T细胞募集的过程。致癌性WNT/β-catenin信号通路的激活阻止了抗原呈递树突状细胞的募集，后者是T细胞募集趋化因子CXCL9和CXCL10的来源。值得注意的是，“良好”的肠道菌群可刺激肿瘤细胞刺激T细胞募集趋化因子的表达。缺乏阻止T细胞浸润的物理因素、存在介导T细胞扩增的细胞因子（例如IL-15）和免疫结构的免疫功能定位是影响IS的正向关键性因素。因此，IS在预测预后方面有较好的效能，它反映了TME中众多免疫和非免疫因素之间复杂的相互作用。IS高的患者可能拥有以上大多数的有利特征。
IS除了作为预后因素外，还可以预测疗效，例如预测针对关键免疫检查点（如PD-1/PD-L1或CTLA4）抑制剂的疗效。
为了促进免疫评分系统更快的应用到临床中，2012年SITC牵头成立了一个全球性的免疫评分工作组。该工作组的首要目标是在一项全球性研究中证明IS的可行性、可重复性、重要性和稳定性。主要发现如下：IS的结果在不同病理中心和操作人员之间可以得到很高的重复性；IS评分越高，复发风险越低；IS是结肠癌复发的独立预测因子；IS对患者DFS和OS的预测价值比现有的肿瘤预后风险参数相当于更好，包括TNM分期（图2）、MSI状态、血管淋巴神经侵犯、肿瘤分化程度等。该研究证明了免疫评分系统在预测结肠癌患者复发风险、DFS和OS等方面的可行性、可重复性、有效性和稳定性。有学者建议在传统的TNM分期基础上，将免疫评分作为癌症分期标准的一部分，即TNM-I分期，这将可进一步提升肿瘤预后评估，更好地识别肿瘤高复发风险的患者，并从免疫治疗结合其他治疗中更好地分层受益患者群。
图2：OS多元分析中的显著性
免疫评分的特征
能广泛的应用到临床的好的生物标志物，应包括但不限于以下特征：常规适用性、可行性、简单性、稳健性和可重复性（表1）。值得注意的是，免疫评分具有所有这些关键特征。
表1：结直肠癌中免疫评分特征
肿瘤相关的细胞毒性T细胞和记忆性T细胞对临床预后的正面影响已在大量解剖学和细胞学上不同的实体瘤中得到证实。这些发现鼓励我们将预后因素研究重点从传统的基于解剖部位或细胞学转向基于免疫研究。与延长生存期相关的主要细胞是细胞毒性T细胞、记忆性T细胞、Th1细胞和新近鉴定的组织常驻记忆性T（TRM）细胞谱系。最近的一项研究证实了在肺鳞癌癌前病变阶段有免疫激活和免疫逃逸（通过免疫检查点的表达）发生。很多研究试图推测在其他癌前环境中有类似的模式发生，例如结肠直肠癌变。迄今为止，尚不存在根据患者发生原发肿瘤的癌前病变对患者进行分层的生物标记物或检测方法。确定免疫评分或免疫评分样测试是否可以预测患者在癌前病变期的生存和转化将具有极大的意义。通过对癌前病变的患者进行分层，可以对高风险患者亚组实施有效的治疗（例如检查点抑制剂）。
免疫评分并非没有缺点。首先，它是一个定量测定，使用数字病理系统计算CD3+、CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的密度。大量的T细胞浸润肿瘤。实际上，来自切除的结肠癌的CD3+ T细胞平均为88,000个/玻片。将H＆E染色光镜TILs评估与免疫评分进行比较，不一致性达到48％，这突出了数字病理学对正确和可重复评估的基本需求。这代表第一个需要数字病理学的生物标记物出现，尽管它已显示出高性能，但尚未被病理学界完全接受。免疫评分染色需要严格的病理学和实验方法，偏离预先定义的标准操作程序可能会导致IS定量错误。为确保该测定的稳定性，HalioDx已开发出一种经批准的临床使用的体外诊断性免疫评分测定法（CE-IVD）。此外，免疫评分也可以在美国临床实验室改进修正案认证的实验室中进行。在实际临床中，有许多的样本是来自转移的活检，IM区域并不能获取，这对评分效果造成影响。因此，已经开发了用于活检的免疫评分（无需IM进行定量）并将其与用于切除肿瘤的共识免疫评分进行比较。活检的免疫评分可以显著预测患者的预后，但其强度不及合并IM的免疫评分。此外，活检的免疫评分（不使用IM）与免疫评分相比，测试特异性敏感性或假阴性假阳性结果的ROC曲线显示了77％的敏感性和96％的特异性，说明了活检的免疫评分有评估的良好性能。
肿瘤的免疫控制理论实际上适用于所有实体肿瘤，因此可以将免疫评分引入作为肿瘤的预后免疫参数加以推广。当然，这并不排除随后的评估以及可能添加其他标记。最近的研究表明，TIM-3+PD-1+CD8+T细胞浸润与肾癌（RCC）的临床不良预后相关。值得注意的是，RCC是T细胞具有阴性预后价值的特殊例外之一，这可能是与表型耗竭相关。因此，对其他耗竭参数的评估可能有助于判断看似不合适免疫评分评估的肿瘤的预后。
作为阿斯利康和INSERM之间正在进行的合作的一部分，当前论文的作者及其研究团队致力于了解免疫评分在其他适应症（包括胃癌、NSCLC、SCLC、SCCHN、TNBC、卵巢癌和膀胱癌）中的预后意义。免疫评分不仅有预测预后的功能，也可能可以预测对包括免疫治疗在内的新型治疗方法的临床反应，从而突显其作为预测性生物标志物的潜力。该假设必须在前瞻性临床试验中进一步验证。
术语“热”和“冷”肿瘤已越来越多地用于根据其免疫浸润程度（分别为高和低）来区分肿瘤，但目前尚无关于这些类型定义的一般共识，不过已经在共识免疫评分的基础上更加标准化和明确的肿瘤类型定义迈出了一步，同时引入了两个中间类别（altered-immunosuppressed和altered-excluded）。通过基于T细胞浸润对肿瘤进行分层，免疫评分可作为鉴定不同类别的单药或联合疗法治疗反应的工具。此外，了解疾病分子亚型的免疫系统变化是非常重要的。
人类肿瘤免疫系统全景和分子亚型
细胞形态学、基因突变状态、细胞起源、肿瘤细胞基因表达和分子途径是用来区分CRC众多亚型的肿瘤细胞特征。最常见的是基于形态学的分类（粘液性、印戒细胞、髓质、微乳头、锯齿状、网状粉刺型、腺鳞状、梭形细胞和未分化）。这些分类标准都没有很强的预测价值。
肿瘤分类的其他方法基于基因突变分析，包括癌基因、抑癌基因和抑制转移基因，也可以通过分子途径进行分类：染色体不稳定，MSI和CpG甲基化表型。例如，使用全基因组mRNA表达谱已经确定了肌层浸润性膀胱癌的分子亚型与基底型和Luminal型乳腺癌的分子特征（例如p53）之间有相似性。最近，转录组学分析确定了四种具有明显预后特征的CRC共有分子亚型（CMS），包括经典基因组和免疫特征。MSI可作为对PD-1/PD-L1抑制剂反应的预测生物标志物，可能与高肿瘤突变负荷（TMB）和MSI-H肿瘤新抗原产生有关。发现MSI-H肿瘤中增加的免疫原性肽数量与TILs呈正相关，可能是由于免疫参与更高以及在肿瘤中PD-L1表达增加。此后，美国食品药品监督管理局（FDA）加速了对帕博利珠单抗用于MSI-H或dMMR实体瘤的批准。高的非同义TMB也正在成为潜在的肿瘤基因决定因素，与无进展生存期（PFS）和临床获益正相关，并与更高的新抗原负荷相关。此外，适应性免疫增加通常与MSI-H和高TMB有关，可阻止肿瘤转移，而且极少有MSI-H患者（<5％）发生转移。免疫微环境的不同改变与转移性侵袭有关。远处转移的发生是由于淋巴管和TILs减少，因此，免疫表型可能是阻止肿瘤细胞转移扩散的主要决定因素。这些结果具有重要的临床意义，并且可能会影响增强T细胞功能（CTLA4、PD1和PD-L1抑制剂）疗法的临床试验的结果。研究支持在疾病早期使用基于T细胞的免疫疗法来预防转移，并建议对原发肿瘤进行免疫分析可能有助于预测转移的存在和发展。最近，对来自大肠癌转移的纵向数据的分析揭示了基因进化模式取决于转移部位的免疫结构。免疫编辑和免疫评分是临床预后的最佳预测指标。因此，这些参数可用于根据其复发的可能性对肿瘤和转移进行分层。在提出的“并行免疫选择模型”中，发现持续存在和进展的肿瘤细胞具有免疫豁免特性，即未经编辑或无免疫原性：这些应成为靶向治疗的靶点。总之，这些结果强力证明，进一步了解转移过程有助于为晚期肿瘤患者开发新疗法。在个体化治疗时代，淋巴结和远处转移患者可能需要不同的免疫疗法，因为他们的免疫逃逸机制可能不同。
免疫疗法合适的临床试验设计
免疫治疗成功应用于肿瘤治疗的报道越来越多。例如，Sipuleucel-T治疗前列腺癌，Ipilimumab治疗黑色素瘤，以及帕博利珠单抗联合化疗治疗NSCLC。有效的免疫指导似乎可以更好地指导基线（治疗前）的治疗选择。目前，我们是根据临床预后、OS或PFS评估抗肿瘤治疗（包括免疫疗法）的性能。新近研究提示，我们可以通过评估治疗过程中的免疫反应来更早地监测疗效。值得注意的是，与标准疗法相比，激活和成功建立免疫效应器所需的时间通常会导致临床客观反应延迟。延迟反应最终导致了肿瘤的“耀斑”或假性进展。临床试验设计应在后期而不是早期纳入治疗反应率，以避免低估免疫检查点抑制剂的真正临床益处。
新型生物标志物和测定方法的使用也已成为迫切的需求。除了直接涉及TME的生物标志物和方法外，评估循环成分，例如血液系统、骨髓系统或其组合，似乎也成为了潜在标记物。目前大多数研究对使用疫苗或诱导的自体免疫反应的临床评价疗效方法，使用的标准是公认的、外部验证的和协调一致的免疫测定方法。然而，迄今为止，缺乏可靠的免疫生物标志物指导标准。
评估临床试验样本中免疫成分与免疫疗法反应关系的数据不断涌现。拓宽对免疫疗法敏感的标记物和疾病分子亚型关系的认识，可能有助于更好地识别对靶向治疗联合免疫疗法受益的患者。比如，奥拉帕尼是一类抑制DNA修复的PARP酶的抑制靶向药。已知跨分子畸变的免疫表型差异（例如BRCA1，BRCA2）和同源重组修复途径中的突变可推断出对PARPi的反应。需要这种详细的了解才能预测PARP抑制剂对免疫检查点抑制剂的增敏程度，例如PD-L1抑制剂或其他免疫疗法。
免疫疗法未来的挑战与机遇
人们普遍认为，肿瘤是由于一种或多种免疫调节关键基因失败而导致的。当肿瘤免疫失控的关键步骤是T细胞衰竭/功能障碍时，免疫检查点抑制剂（ICI）可获得临床益处。针对肿瘤细胞表面分子、生长因子或维持肿瘤生长的细胞因子受体的多种治疗性抗体已投入临床使用。许多研究表明，基于肿瘤特异性T细胞的转移、活化、扩增或阻断的免疫疗法在临床上取得了成功。且当取得成功时，持续时间通常是持久的，这进一步使我们认识到，使全身和局部肿瘤特异性T细胞活化是处于癌症治疗的最前沿。
尽管取得了这些令人鼓舞的结果，但ICIs的疗效在各种适应症中并不一致，而且反应率还远非最佳。这些临床反应差异可能有几种机制。ICI的功效要求肿瘤组织预先存在强大的免疫浸润，并能产生有效的抗肿瘤免疫反应。值得注意的是，这与免疫评分的提示预后的机制有相似之处。为了增加临床获益，这些免疫治疗可以与化疗、放疗或靶向治疗组合以减少肿瘤负荷并增加肿瘤免疫原性。随着联合治疗可能性的增加，为免疫联合其他治疗提供合理的、准确的生物标志物也迫在眉睫。在各临床试验注册中心可以看到免疫治疗联用其他疗法多种方式，但效果仍欠佳。这种联用方法不成功的可能原因是，某种肿瘤不同病理类型以及不同肿瘤之间，免疫微环境不同。以后极有可能的是，选择治疗方案将不仅需要考虑肿瘤类型，而且需要考虑肿瘤相关的免疫参数。
肿瘤微环境中免疫系统随着肿瘤的发展以及临床预后的不同而变化，这更额外的增加了的肿瘤微环境的复杂性。只有对不同类型免疫细胞时空相互作用的综合评估，以及对某种恶性肿瘤致癌驱动因素的了解，才能明确肿瘤进展过程中肿瘤与免疫系统相互作用的复杂动态。尽管如此，现有的与免疫相关的参数，例如免疫评分、肿瘤驱动因素、TMB、LOH HLA、PD-L1和特定免疫基因表达特征的存在已经被用于进一步推进肿瘤分类。免疫评分已经通过了详细的共识性方案，并且获得了CE-IVD批准，这一事实使其成为改善患者分层需求的理想解决方案。但是，因为公共卫生服务不能报销免疫评分的费用，所以目前其广泛使用受到限制。从这个意义上来说，英国迈出了第一步，2019年1月，英国一家私人医疗保险公司可以全额报销免疫评分的费用。由于新型免疫疗法的疗效有限，再加其高昂的费用，使得患者经济负担大，不能持续使用。如果有例如免疫评分之类的诊断测试帮助医生根据每个患者的生物学行为制定治疗方案，可以使治疗更加精准，为整个社会节省不必要的医疗资源浪费。
排版编辑：Nathan
Angell Helen K, Bruni Daniela,Barrett J Carl, et al. The Immunoscore: Colon Cancer and Beyond.[J]. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research,2019.