【资料】关于四眼斑水龟的繁育研究

新年新始，什么玩意儿也来点新的变化，在原有自己胡诌的基础上多介绍一些国内不错的龟类研究论文，并对原有的论文进行分段式解读。简单来说就是“什么玩意带你解读国内龟论文”的意思。

由于论文篇幅较长，我只节选其中部分我觉得有意义的段落进行解读，想看完整版的，切记请务必尊重他人原创版权。

生态养殖法成功繁育濒危物种四眼斑水龟的研究

张 杰 廖广桥 李 闯 胡茂柜 庞贤鹏 陈 义

指导教师:史海涛 教授 洪美玲 副教授

摘要:四眼斑水龟(Sacalia quadriocellata)被国际自然保护联盟(IUCN)列为濒危物种，人类对该物种的需求日益增长，人工繁殖一直不成功，其野生资源遭到持续破坏，种群数量急剧减少，在很多区域已濒临灭绝。在龟类资源遭受严重破坏的今天，龟类养殖被世界各国同行公认为挽救濒危龟类惨遭灭绝最急迫也是最有效的方法之一。以往对四眼斑水龟的人工驯养繁殖也有过许多尝试，但均不成功。我们自 2007 年 1 月至 2009 年 3 月，在饲养条件下通过改变饲养环境、光周期、食物组成等，以生态养殖法和卵孵化条件的严格控制，在饲养条件下连续两年繁殖出两批共 8 只健康生长的幼体，首次成功突破了四眼斑水龟在人工养殖条件下的繁育问题，为减轻该物种野生种群的压力及人类对该物种的可持续利用提供了机会，也为其他濒危龟类的人工驯养繁殖提供了范例。

我的解读

近几年我国原生的龟类关注持续升温，但实际上它们的种群数量却并没得到彻底的改善。除了熟识的、缘、喉、草等龟类有批量繁育的情况外，眼班、四眼、枫叶、锯缘、黄额、凹甲、鹰嘴等等等却鲜有繁育经验分享。今天的四眼繁育论文希望就能为国龟的繁育做出一点小小贡献。

对四眼斑水龟的人工饲养均以只能饲养而不能繁育告终，无法缓解市场对野生种群的需求，间接导致野外种群数下降(夏金叶, 1983; Rodel, 1985;宋憬愚等, 2002)。四眼斑水龟人工的驯养繁殖的研究已有很多尝试，但均不成功(周婷, 1997;王志伟等，2005)。主要原因是该物种生性胆小，在人工饲养环境下难以满足其野生山涧溪流的独特生存环境和食性，正常的行为受到严重抑制，始终处于紧张和不适应的状态而无法正常生存和繁殖。早期的死亡率高达85%，主要是腐甲病、水肿病、肠胃病等(王志伟等，2009)，没有任何繁殖行为的表现。本课题组从2004年到2006年曾经尝试用激素诱导的方法克服其室内繁殖障碍的难题，有效促进了繁殖行为的表现，并产下3枚卵。但遗憾的是未能孵出幼体。即便能够成功繁殖，人为注入外源激素的使用也会使繁殖个体和其后代以及利用这些龟类产品的人类产生长期的负面影响。

实际上温度、光周期、降雨量、湿度和食物供应等外界因子均可通过直接或者间接的途径影响龟类的繁殖(Duvall et al., 1982)。光照等环境因子可以直接引起生理变化和机体内在节律的表达，从而影响龟类的繁殖;人工饲养条件下频繁的人为干扰将明显胁迫龟类的正常繁殖;只有当机体摄取的营养物达到身体所需的某一临界值时其性腺才会正常发育以完成繁殖(Kuchling, 1998)。

为探究出一套适用性较强并易于付诸大规模养殖推广的技术，满足人们对该物种的大量需求及减轻野生种群的压力，实现成功繁殖且保证成功繁殖出的个体无外源激素污染的负面影响，本课题主要利用即将被烹调的自宾馆饭店抢救来的四眼斑水龟，开展了一系列生态养殖法的研究，取得显著成效。

我的解读

四眼作为我国国产的龟种之一，并没有受到广泛的关注，甚至鲜有人知海南野外也分布着不少。对于它的繁育与研究其实早有十几年之久，但均以失败告终。与龟友自行繁育成功不同，很多学者繁育成功或失败均会分享有一定数据参考的经验，以供后人学习，我觉得这也是未来龟友圈值得学习的一点。

材料与方法
参与实验的 56 只四眼斑水龟(30♀，26♂)主要自海南岛琼中地区，已在本实验室饲养多年。采用数字监控保安系统记录个体发情求偶和产卵等行为，运用全事件取样法和瞬时扫描取样法观察记录行为。每月对雌性个体进行超声波检测，记录卵泡发育情况;并以 X 光投射法确定硬壳卵的数量。卵泡个数统计公式:检测到卵泡数(枚)=左右鼠蹊部检测卵泡数之和(包括闭锁卵泡)。生态养殖池的建设面积为 33 m2，且池内土壤、石块、植被等均采自琼中湾岭地区四眼斑水龟典型的野生环境。

1.1 减少胁迫试验

2007年之前所有个体均混池饲养于80cm×60cm的水池中，饲养密度为10只/m2，饲养密度过小将直接引起个体间频繁的冲突而影响雌性正常繁殖，且频繁进出饲养室、日常的喂食换水及测温度都将引起较为严重人为胁迫。针对以上问题:2007年8月至2009年5月将24只个体(12♀，12♂)饲养于室外以遮阳布处理且放置有四眼斑水龟野外生境中的石头、植被等物，面积为33m2的池子(简称“生态池”)中，严格控制进出生态池的频次，减少喂食换水和测温度的频次。

1.2 补充食物营养试验

本实验室自 2002 年开始至 2006 年 12 月，室内饲养四眼斑水龟以甲鱼2号饲料 1:1 混合自来水，同时间断的每次投喂一种肉类或植物性食物(水果和蔬菜)饲喂四眼斑水龟，发现其喜食饲料和肉类，极少摄取植物性食物，这与其野外以植物性食物为主相悖(史海涛等，2002)，且导致营养单一以致将威胁其健康。为提供更加丰富的营养和合理膳食即采取以下途径:自 2007 年 2 月给予 8 只雌性个体采用绞碎机将 32 种食物(包括:胡萝卜、香菜、瘦猪肉、西葫芦、椰子菜、苦瓜、绿豆芽、白萝卜、空心菜、牛肝、黄豆、西红柿、南瓜、茄子、菜花、红薯、菠菜、生菜、鸡蛋、鱼、香菜、黄豆芽、芹菜、地瓜叶、西瓜、黄瓜、大白菜、猪肝、玉米、韭菜、小白菜、莴笋叶)绞碎成汁按照 1:1 配合混合饲料活成面团进行投喂以丰富和补充个体所需营养，同时根据各种食物的营养含量合理搭配(每次仅选取其中 2—3 种食物投喂)，每次所加食物均按照等量配比后绞碎成汁与甲鱼 2 号饲料 1:1 混合。食物种类均结合王志伟(2005)对饲养条件下四眼斑水龟食性的研究结果选择四眼斑水龟喜食食物。

1.3 光照影响性腺发育试验

四眼斑水龟饲养于室内多年但池内无自然光照射，池内光强始终为零，表现为光周期不明显，从而可能引起体内褪黑素(MLT)分泌增多而抑制“下丘脑—垂体—性腺”轴的功能，使得生殖激素的分泌减少而影响正常繁殖，为进一步探究光周期等环境因子对四眼斑水龟繁殖的影响，2008 年 10 月至 2009 年 3 月将28 只四眼斑水龟(14♀，14♂)均分为两个组:长日照组(15L: 9D)、短日照组(9L:15D)均给予自然光，即在室外饲养，通过 UVB 灯管补光延长光周期，三夹板封盖池口遮光以缩短光周期。

产卵率计算公式:产卵率(%)=产卵个体数/实验个体数

1.5 孵化试验

2007年3月至7月和08年4月至8月分别对本实验室所产下的4枚和8枚受精卵进行孵化。本实验人工气候箱(德国产的 KBWF240# 01-22996 型)设置温度为 24—27°C(2007年控温在 26—27°C，2008 年控温在 24—25°C)，箱内相对湿度控制为 90%。孵化用具为杉木箱 (37cm×30cm×20cm)和塑料盒(34cm×22cm×11cm)，箱子和塑料盒上开有若干小孔，底部分别垫一块纱布，卵底层放置 4—5cm基质，卵表面加 1—2cm的基质。07年以沙土为基质;08 年控温组分别用沙土和蛭石作为基质，常温组为蛭石。每天分 5 个时段(每隔 5 小时左右测量一次)记录每组温湿度，同时根据基质失水情况适当的在其表面洒水，以保持含水量。

孵化总积温计算公式:孵化总积温(°C·day)=孵化日平均温度×孵化天数

我的解读

作为任何实验来说，应该从各个方面事无巨细。通过实验方法，详细向你介绍起因与结果。对于有理有据的科研研究，我非常尊重。

2 结果与分析
2.1 改变饲养条件对繁殖的影响

饲养于生态池中的 12 只雌性个体仅 2 只在放入生态池前产过卵，放入生态池中饲养后有 7 只个体产卵，对处理前后个体产卵数(未产卵个体记为 0 枚)经Mann-Whitney U 检验知差异显著(Z=-2.003, n=24, p=0.045<0.05)。

2.2 补充食物营养对繁殖的影响

在室内单池饲养且按照改善后喂食方案饲喂之前，21 只雌性个体仅 5 只成功产卵;自 2007 年 2 月对 8 只个体按照改进的饲养方法喂养后，2008 年和 2009年均发现 8 只雌性个体中有 7 只成功产卵，经 χ2 检验知处理前后产卵率差异极显著。

2.3 光周期对性腺发育的影响

结合 2008 年 9 月到 2009 年 2 月的 B 超检测(如图 1)可知:短日照组卵泡发育情况好于长日照，对每月检测到卵泡数进行 Mann-Whitney U 检验知两种光周期下各个月份其卵泡数差异均不显著。对经 B 超检测发现怀有硬壳卵个体进行 X 光检测发现:短日照有 3 只个体怀卵，共 6 枚;长日照仅 1 只个体怀卵，共 2 枚。经 Mann-Whitney U 检验知组间产卵数差异不显著(p=0.262>0.05)。

2008 年 11 月至 2009 年 2 月的录像观察发现:长日照组雄性个体有 4 只个体出现明显发情行为，并有成功交配行为，行为占全天时间的 0.617±0.758%(n=6);短日照组有 3 只个体出现发情行为，占全天时间的 0.616±0.731%(n=6)。将两组个体的发情行为进行非参数 Mann-Whitney U 检验，发现差异不显著(p=0.868>0.05)。

2.4 雌雄混放对受精率的影响

结合试验处理后次年产卵情况可知，2007 年有 5 只个体产卵(均来自混放的 13 只个体中)，2 只产下受精卵;2008 年有 10 只个体产卵，4 只产下受精卵;2009 年有 16 只个体产卵，8 只个体产下受精卵。

2.5 孵化结果

2007 年和 2008 年分别对 4 枚和 8 枚受精卵(图 2)孵化，各成功孵出 4 只四眼斑水龟幼体(见图 3)。控制温度在 24—27°C，平均孵化期为 107±11天，平均孵化总积温为 2640.4±191.7°C·day。结合两年的数据可知:常温组孵化率 33.3%(3 枚入孵，1 枚孵出)，控温组孵化率 77.8%(9 枚入孵，7 枚孵出)，经 χ2 检验知:不同组间孵化率表现为差异不显著;其中 07 年控温组孵化率 100%(3 枚入孵，3 枚孵出，平均孵化期为 96±4d)，08 年控温组孵化率 66.7%(6 枚入孵，4 枚孵检测到卵泡数/枚出，平均孵化期为 115±4d)。其中蛭石组孵化率 20.0%(5 枚入孵，1 枚孵出)，沙土组孵化率 100%(7 枚入孵，7 枚孵出)。

我的解读

通过论文的或许很多结论是你早就知道或者猜到了，但其中导致这些结果的原因却未必所有人都能说得清。论文的用处便体现在这里。

3.3 光周期对四眼斑水龟繁殖的影响

结合 B 超检测结果可知，短日照组对雌性卵泡发育有促进作用，长日照组相对表现出一定的抑制作用，这可能是由于四眼斑水龟属于短日照动物。对于短日照动物，在短白昼期间高浓度的褪黑素抑制促乳素释放，刺激 GnRH 和促性腺激素释放增加，性腺活动增强，褪黑素表现为促进繁殖的作用(朱士恩，2006)。长时间处于长光照条件下将导致光钝化而使长光照刺激 GnRH 和促性腺激素释放作用减弱或者停止(张录强，2000)，因此长日照组出现相对的抑制作用。相较于雌性而言，长日照对雄性的作用相对短日照要明显。两组相对比:发情行为占全天时间基本一致，但是长日照组出现明显的交配行为且发情个体多于短日照组。造成雌雄差异的原因可能是由于雄性性腺发育早于雌性(Ganzhorn D，1983)，即雌雄性腺发育机制不同。傅丽容等(2007)报道雄性四眼斑水龟的精子发生期在夏秋季节，冬季为精子发生停滞期。本次录像观察到雄性发情强度均不够明显可能是因为实验期为雄性个体性腺发育的停滞期，光照作用还无法表现，其中缘由有待进一步探究。

3.5 孵化因子对孵化率的影响

温度是动物环境中的重要因素，孵化温度直接影响卵生爬行动物的孵化率和孵化时间(Packard et al，1987)。极端高温、低温导致胚胎不能孵化或畸形率增加甚至死亡(Vinegar，1974)。本实验中常温组在孵化后期温度较高(平均温度达到 30°C)，控温组温度始终相对较低(24—27°C)，而常温组孵化率较低即由于孵化后期温度过高而阻碍胚胎发育以致死亡，此结果与李珊(2002)对乌龟的报道一致。卵生爬行动物卵的孵化期一般都随孵化温度的升高而缩短(Molina etal.,1998;Paez et al.,1998)，对比 07 年和 08 年控温组孵化结果可以发现四眼斑水龟也符合这一结果。然而所有爬行动物卵均具有一个相对的存活孵化温度范围(许雪峰，2003)，且在此范围内卵的质量随孵化期延长而减小(计翔等，1991)，结合本实验结果发现 08 年控温组孵化率较 07 年低的原因即是温度过低而延长孵化期，最终减小卵的质量而降低孵化率，因而可以初步判断四眼斑水龟最适宜的孵化温度为 27—30°C。由于室内和人工气候箱内大气湿度均在 85%左右，处于龟类孵化的最适湿度范围(李珊，2002)，因此湿度在本实验中对孵化率的影响不大。同时究竟以沙土还是蛭石为孵化基质可能对四眼斑水龟的孵化率影响不大。

我的解读

对于光照的结论也是突破我原有认知的，在同种龟类中不同公母对光照的需求竟然有所不同。看来在养龟的路上还有不少知识等着我们的探究。