综述 | TRENDS ENDOCRIN MET：肠道类器官：模拟饮食-微生物-宿主相互作用的工具
编译：艾奥里亚，编辑：小菌菌、江舜尧。
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饮食习惯、微生物菌群失调和肠道微生物代谢物（GMMs）在肠上皮细胞的动态平衡以及在结直肠癌等疾病进程中起着关键作用。虽然GMMs和微生物在许多生物活动中起着至关重要的作用，但目前有关阐述饮食-微生物-宿主关系的模型在很大程度上仅限于动物模型。因此，肠道器官（IOs）的产生为体外平台提供了前所未有的机会，该平台具有足够的复杂性来模拟生理以及病理的饮食-微生物-宿主条件。总的来说，IO对肠道微生物代谢物和微生物的反应可以为这些药物预防或触发疾病的机制提供新的见解，大大扩展了我们对饮食-微生物-宿主相互作用的了解。
论文ID
原名：Intestinal Organoids: A Tool for Modelling Diet-Microbiome-HostInteractions
译名：肠道类器官：模拟饮食-微生物-宿主相互作用的工具
期刊：Trends in Endocrinology and Metabolism
IF：9.777
发表时间：2020年3月9日
通信作者：Josep Rubert
通信作者单位：意大利特伦托大学
综述内容
1 饮食，微生物菌群和肠道微生物代谢物
食物除了有明显的营养价值外，还与人体健康息息相关。尽管如此，食物与肠道微生物菌群、宿主遗传学和其他环境因素之间的复杂相互关系也是疾病传播所必需的。食物摄入后，在胃肠道（GI）中被消化成大量不同的小分子，其中一些被肠壁吸收，另一些则被肠道微生物群进一步加工。肠道微生物菌群由胃肠道的数万亿个微生物组成。这些微生物决定了通过饮食、药物和外源生物摄入的大多数化合物的化学结构、寿命、生物利用度以及生物活性。然而，人们对饮食模式、肠道微生物菌群组成和转基因生物在组织动态平衡以及器官生理学中的相关性知之甚少。
欧洲癌症与营养前瞻性调查（EPIC）研究是世界上最大的队列研究之一，它探究了食用水果、蔬菜和纤维与降低患不同形式癌症的风险之间的联系。大量摄入如多酚、纤维和抗氧化剂化合物等植物化学物质，通常会降低胃肠道癌症的风险。然而，关于某些天然植物化学物质或GMMs发挥特定生物活性的机制，尚未被解决。
到目前为止，研究食物成分对肠道炎症、毒理学相互作用、微生物组研究或化合物的潜在生物活性（如多酚抗癌）的影响的最常见方法是将这些天然分子注入到各种人类2D细胞系中。然而，这类研究存在两个主要的问题：
（i）有些分子的生物学效应通常与其代谢物相关而非化合物本身；
（ii）在塑料薄膜2D单层膜上生长的永生化和肿瘤细胞系在最小程度上重塑了与3D组织结构相关关键的细胞复杂性、拓扑结构和分子信号。
虽然这些在大多数生物活性化合物和感兴趣的器官疾病中很常见，但在肠道中，由于肠上皮的精确细胞拓扑结构、饮食代谢产物不断影响肠上皮的事实以及细菌和肠上皮细胞之间复杂的相互作用，这使得这些问题在胃肠道疾病中尤其重要。为了克服这些问题，使用了不同的动物模型，提供了比2d模型更优越的复杂性。然而，在这些有机体中的代谢调控和肠道微生物通常有别与其在人类肠道中的代谢调控和肠道微生物，同时人性化的模型也不一定反映人类所看到的真实关系。在后一种情况下，肠道微生物被移植到一个没有共同进化且没有生态因素（如饮食和疾病基因型）的宿主中，会导致最初的稳态失调。
2 肠道类器官培养揭示了植物化学物质在组织稳态和疾病中的作用
最近，用于建立IOs的方案表明，来自成人组织活检和切除的细胞在体外具有存活、增殖和自组织成三维结构的能力（图1），这些三维结构能够很好的重塑组织的起源。因此，在一些意在破译正常组织稳态的研究，甚至是探究与疾病发生、进展和治疗相关的分子机制方面的研究中，3D IOs已被证明是一个有价值的模型系统。
肠上皮是一种高度组织化、自我更新的组织，具有增殖的隐窝区域和分化的绒毛。隐窝底部的干细胞通过产生transit-amplifying cells保护了肠上皮的持续细胞周转，然后分化成各种类型的肠上皮细胞，如潘氏细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和肠细胞等。为了评估GMMs或微生物对肠道健康的影响，一个理想的模型应该是保持体内细胞的多样性，并保留肠上皮的基本生理功能。
目前有研究发现，从小鼠小肠建立的类器官（organoids）在培养过程中保留了肠上皮的主要特征，可以用于研究营养运输、营养传感和激素分泌。随后，人类IOs被用来模拟消化过程中的营养运输生理学，而小鼠IOs被用来确定饮食脂肪吸收的肠道机制。在这一点上，一些研究小组着手于探究各种可以促进或影响肠道上皮健康的化学物质和饮食成分。有研究人员通过探究不同膳食成分对IO生长的影响发现，几种饮食成分对IO生长没有显著影响。但，caffeicacid以浓度依赖的方式抑制类器官的生长。caffeic acid浓度越高，隐窝状结构越少，这与前人研究结果相一致；但该研究结果中monosodium glutamate和chlorogenic acid等结果与以前的研究不一致。这表明，使用类器官来探究植物化学物质仍处于初级阶段。未来的研究必须仔细制定实验设计，不仅要考虑到结果可能提供与体内模型相关的有价值的见解，还要考虑到观察到的反应仅限于肠道的上皮成分。
除了饮食在调节肠上皮稳态中的作用外，来自恶性结直肠病变的类器官也为研究饮食对肿瘤发生的影响打开了新的机会之窗。最近的研究，将IOs作为临床前模型系统，探究了Flavan-3-ols（一种溶解在DMSO中的商业葡萄籽提取物，包括单体、二聚体和三聚体）在CRC中的化学保护作用。Flavan-3-ols通过抑制细胞周期和诱导程序性细胞死亡，持续抑制APCMin小鼠IOs的形成和生长，并抑制人CRC肿瘤的未宣布的临床病理特征。从机制的角度来看，基因表达揭示了Flavan-3-ols处理的类器官中增殖和自我更新通路受到抑制。尽管如此，但从营养角度来看，proanthocyanidins（PAC）一旦被引入胃肠道，就会受到广泛代谢的影响。这些化合物可以几乎完好无损地到达远端胃肠道，在那里它们被结肠微生物菌群有效地转化为低分子酚类化合物。因此，到达结肠的Flavan-3-ols单体、二聚体和三聚体可供肠道微生物菌群使用。随后开始分解代谢，产生hydroxy-phenyl-γ-valerolactones（PVL）及其衍生的hydroxy-phenylvaleric acids （PVA），只剩下一小部分未代谢的PAC。
截止到目前，大多数研究都调查了植物化学物质在IOs模型动态平衡和致癌中的作用。然而，据我们所知，通过饮食相关代谢物或肠道代谢物（GMMs）在存在或缺乏致癌剂的情况下的保护作用来启动和传播癌症还没有被探索过。总体而言，来自正常或病变组织的IOs为研究饮食成分对细胞行为的影响提供了一种补充机制。尽管这项技术是破译影响人类的不同病理过程的重要工具，同时反过来潜在地使我们能够确定可以对抗疾病的机制，但实验设计应该重新考虑以下几方面内容：（i）固有饮食成分的消化和微生物分解代谢，以了解它们的新陈代谢，并确定那些到达肠道上皮的化合物；（ii）理想情况下，应该评估健康的和与疾病相关的IO反应；以及（iii）在用代谢物和饮食成分进行实验时，应充分考虑肠道的正确极性，以模拟apicobasal膜为靶点的全身暴露或者是apical膜为靶点的luminal暴露。
3 肠道上皮微生物菌群引起的结构和功能变化
目前有关微生物组的研究不仅是简单地描述微生物菌群，而越来越多地利用功能宏组学方法来表征微生物功能。通过结合宏组学方法，可以获得功能谱，从而可以提供菌株水平的分类解析，评估编码基因的潜在功能，并量化复杂微生物组内发生的代谢活动。例如，对2型糖尿病（UCD-T2DM）大鼠盲肠内容物的细菌DNA进行鸟枪法宏基因组测序，同时结合代谢组学分析的结果，支持了糖尿病特异性宿主信号在控制饮食、年龄和居住环境方面可以影响肠道微生物菌群生态和GMMs这一观点。此外，通过对活性和微生物进行分析还可以揭示肠道微生物菌群和人类疾病之间的重要联系。
肠上皮是检测肠道代谢物（GMMs）和微生物的主要部位，两者都可以通过对肠上皮细胞发挥生物活性来发挥局部作用（图2）。诸如短链脂肪酸（SCFA）的纤维衍生化合物对宿主健康和疾病都有影响。虽然这些微生物和与饮食相关的代谢物的重要性逐渐受到人们的重视，但它们在人类肠道上皮细胞中的作用仍然难以确定。Schilderink等人探究了SCFAs是否能够诱导分泌影响上皮稳态的旁分泌因子。有趣的是，丁酸在人和小鼠的IOs培养中分别增强了ALDH1A1和ALDH1A3的表达。这项工作为IOs在破解健康条件下肠上皮和微生物群之间生理相互作用中的重要性提供了数据支撑，并确定了丁酸能够通过诱导retinoic acid 的合成而有助于维持肠道内环境平衡的新机制。此外，Bellono等人通过实验发现了IOs在破译某些GMMs的作用方面的适用性。基于这些最新的研究发现说明，IOs是探究肠道微生物菌群产生的化学信号的一个极好的生物系统
研究微生物对肠上皮的影响比研究代谢物的影响要复杂得多。肠道上皮是微生物与宿主相互作用的地方，复杂的微生物混合物必须被引入到类器官的管腔中。但这在技术上仍具有挑战性。人类和小鼠的IOs可以精确地模拟肠道结构、管腔可及性以及组织极性，到目前为止共有三种方法可以将微生物导入类器官中：（i）类器官组织的破坏；（ii）源自IOs的2D培养以及（iii）显微注射。对于第一种方法来说，一旦类器官被破坏，它们就会暴露在顶端，此时，分离的细胞可能会与微生物相互作用。人们对Lactobacillus reuteri D8对与干细胞生态位的影响知之甚少，但一项联合培养IOs和固有层淋巴细胞（LPLs）的研究阐述了Lactobacillus reuteri D8的保护作用（该菌在保护肠粘膜完整性方面起到关键作用）。通过研究作者发现，在肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作用下，L. reuri D8可促进IOs的生长，并保护器官形态。在该研究中虽然也观察到表达Lgr5的细胞水平升高，但该抗体仍需要使用基因敲除动物的组织进行验证。作者认为，L. reuri D8通过arylhydrocarbon receptors（AHRS）刺激LPLs分泌IL-22，从而使STAT3磷酸化，进而加速肠干细胞的再生。为了暴露apical部位，另一种选择是将类器官分离成单个细胞，并将这些细胞接种到胞外基质或涂布的培养皿上，然后将微生物直接加入培养基中，允许微生物和宿主细胞单层之间的相互作用。最近，已经开发出一种新的技术，它可以改变IO的极性，从而使apical表面始终面向介质。这个新出现的有效模型可以探测屏障的完整性和营养吸收，并可能为研究饮食-微生物-肠道上皮的相互作用打开新的可能性。
目前我们所提及的方法主要针对与好氧细菌进行，但大多数肠道微生物是厌氧微生物。采用微注射的方法将微生物微注入IOs腔中（估计10%的O2），以克服在正常氧浓度下生长的IOs去对厌氧微生物进行研究。在该研究中，作者利用了高通量微注射方法的优越性，有助于有效且可反复地注射到肠道类器官的管腔中。与这一技术的优势相同，本研究表明，粪便移植后，好氧和厌氧群落可以转移到IO腔中并进行为期4天以上的培养，经过培养后其微生物群落的相对组成变化不大。在不同类器官中，其细胞的数量和类器官的大小各不相同，因此，在进行具体微生物时应根据尺寸参数进行标准化处理。
4 评估肠道细胞器对微生物和GMM相互作用的响应的策略：从整体组织到单细胞
采用细胞和分子的评估手段证实了肠道类器官（IO）对GMM和微生物的响应。然而，要了解这些与上皮细胞的相互作用的基本机制以及上皮细胞所产生的响应，有必要采用多种组学方法来进行研究。组学方法传统上是在生物液、均质组织或均质细胞上进行的，对基因表达、蛋白质组或代谢组的平均水平进行测定。由于代谢物既代表基因组的下游输出，也代表来自环境的上游输入，因此IOs的体外代谢和体内代谢可以阐明影响IOs和肿瘤的重要代谢过程。然而，整体组学方法，如蛋白质组学和代谢组学，消除了所有的空间信息、形态和异质性，而这些信息对于解开这种复杂的真核-原核生物网络的本质是至关重要的。为了克服这些限制，质谱成像（MSI）已经成为在单个细胞分辨率下评估组织异质性的一种新的有效工具。因此，通过确定已知或未知分子物种的空间分布和丰度，MSI可以确定IO上皮中特定GMMs的细胞分布、这些化合物在代谢物中的生物转化以及肠道细胞对该化合物的代谢和/或蛋白质组学反应。
总结以及展望
人们对于“营养和肠道微生物菌群”领域的了解正迅速的发展。目前已有的研究明确了在摄入植物化学物质和纤维之后，肠道微生物开始了复杂的微生物菌群分解代谢，释放出重要的肠道微生物代谢物（GMMs）。总的来说，营养素、GMMs和微生物群落维持着肠道上皮的健康稳态。相比之下，西方的饮食模式促进了微生物和GMMs的发展，这些微生物和GMMs会对肠道上皮产生负面影响，并可能加速疾病。在大多数情况下，研究分别描述了肠道群落中存在的微生物以及不同生物液中的蛋白质或代谢物。虽然最近的多组学方法揭示了肠道微生物群和人类胃肠道疾病之间的重要联系，但迄今为止，GMM和基因之间的相互作用如何对干细胞生态位造成影响的机制还很少受到关注。
肠道类器官（IO）培养模型已被证明是反映上皮细胞行为的有力工具。在此基础上，健康的IOs和类肿瘤提供了几个独特的优点：
（i）能够研究源于正常和疾病组织的类器官细胞型的内在机制；
（ii）可以探索由几种与饮食相关的化合物、GMMs以及微生物驱动的蛋白质表达、定位、活性以及细胞内的信号传递过程。
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