科研 | 肠道微生物组是小鼠模型中全面防护急性砷中毒所必需的
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导 读
砷是一种有毒的非金属和人类致癌物，据估计，世界范围内约2亿人通过食用受污染的食物和饮用水造成砷中毒。肠道微生物组被认为可以减轻或加剧砷的毒性，但目前还没有研究提供直接的体内证据证明哺乳动物微生物组可以加重或保护宿主不受砷相关的病理或疾病的影响。
论文ID
原名：The gut microbiome is required for full protection against acute arsenic toxicity in mouse models
译名：肠道微生物组是小鼠模型中全面防护急性砷中毒所必需的
期刊：Nature Communications
IF：12.353
发表时间：2018年12月
通信作者：Michael Coryell, Mark McAlpine, Nicholas V. Pinkham, Timothy R. McDermott & Seth T. Walk
通信作者单位：epartment of Microbiology & Immunology, Montana State University. Department of Land Resources and Environmental Sciences, Montana State University.
实验设计
常规小鼠饲养在无特定病原体的条件下（包括鼠诺罗病毒），即具有无菌寝具的单独通风的笼子中。将GF小鼠圈养在密封的和Hepa过滤器通风的乙烯基隔离器中，并接受高压灭菌的水和食物。对GF小鼠的所有食物和水进行隔离、监测和污染测试。
最初通过用头孢菌素抗生素头孢哌酮（Cef）实验性破坏实验室饲养的野生型（WT）小鼠的细菌群落来定义微生物组在体内砷解毒中的作用。选择不同性别且年龄匹配的小鼠（7-13周龄）分为Cef处理组和Sham组，进行砷暴露实验。
图1 砷暴露实验设计图
实验内容
1. 微生物组破坏影响砷的排泄/生物累积
对野生型（WT）小鼠进行砷暴露实验后结果看出，与假处理组相比，Cef处理的小鼠粪便中排出的砷显著减少（25ppm组减少87±6％，100ppm组减少93±3％）（图2a）。说明明在Cef处理的小鼠体内保留了更多的砷，并且对器官的评估证实了总砷积累，其中肺和肝脏中积累显著（图2b）。结果表明微生物组通过粪便排泄减轻宿主暴露和吸收摄入的iAsV。
图2 野生型C57BL/6小鼠粪便和宿主组织中的砷含量
2. As3mt和微生物组是防护所必需的
与WT小鼠相比，砷（+3氧化态）甲基转移酶缺陷的小鼠（As3mt-KO）在砷甲基化中功能失调。作者假设As3mt-KO小鼠对高剂量的砷更敏感，并且在微生物组被扰乱后毒性会增加。作者用As3mt-KO小鼠进行了同WT小鼠相同的砷暴露实验。在暴露于25ppm iAsV长达22天的Sham处理组未观察到毒性。然而，暴露在相同水平的Cef处理组的As3mt-KO小鼠到第12天时有一半死亡（图3a）。在100ppm iAsV时，在Sham和Cef处理组中均观察到死亡（图3b），且Cef处理组的小鼠死亡速率更快。
为了量化微生物组缺乏的存活期，增加iAsV的浓度水平，将As3mt-KO小鼠暴露于10, 25和100ppm iAsV中，观察到剂量依赖性死亡率（图3c），表明毒性随暴露的砷浓度增加而增加。相比较，WT小鼠仅在暴露于100ppm iAsV中40天的22只中有2只死亡（第19天和第38天各一只）。因此，As3mt和一个完整的肠道微生物组都是充分防护砷毒性所必需的。
图3 GF As3mt-KO小鼠的Cef处理组、Sham处理组于砷暴露后的存活率
3. 人体粪便移植提供全面保护
对As3mt-KO小鼠进行人源化实验以确定人类微生物组是否可以提供对砷的防护。在iAsV暴露之前，以口服强饲法将来自健康人供体的粪便移植到受体GF As3mt-KO小鼠（F0）中并平衡10天后进行100ppm的iAsV暴露实验。同时，将相同的粪便移植到妊娠GF As3mt-KO大坝中，以便后代（F1）从出生时就同这种微生物组共同发育。将F1小鼠抚养到与F0小鼠暴露时相同的年龄后进行100ppm的iAsV暴露实验。结果显示无论何时获得微生物组（图4a），F0和F1的平均存活率与假处理组As3mt-KO小鼠没有显著差异，说明移植的人粪便提供了对100ppm iAsV的充分防护。这些结果成为人体肠道微生物组为砷诱导死亡提供防护的体内证据。
4. 砷防护的供体依赖变异
人体肠道微生物组的物种组成在人与人之间差异很大。作者使用五组接受了来自不同健康成年供体的粪便移植的GF As3mt-KO小鼠暴露于100ppm iAsV。所有人源化微生物的组其存活期均明显长于GF As3mt-KO组。然而，在人源化小鼠组之间观察到显著不同的存活期，平均存活时间为17至36天不等（图4b）。使用两个供体组进行独立（重复）实验，一个比另一个提供更好的保护。因此，人类粪便移植揭示了个体间防护砷中毒的差异。
图4 iAsV 暴露的人源化As3mt-KO小鼠的存活率
为了鉴定潜在的细菌多样性存活模式，作者在砷暴露开始时（第0天）以及第7天对人源化小鼠的粪便样品进行16S rRNA基因测序。人源化小鼠的微生物组在供体组（即，共享相同供体的小鼠）内比在供体组之间更相似（图5a）。在砷暴露的第0天和第7天之间在所有组中观察到微生物组结构发生显著变化（即，分类群的存在-缺失和相对丰度），说明砷扰乱了肠道微生物组。然而，组之间的扰动程度显著不同，表明扰动取决于起始微生物组（图5b）。总体而言，这些结果表明肠道微生物组在砷胁迫下维持分类完整性的能力对于宿主存活是重要的。
图5 砷暴露中微生物组稳定性的差异
5. 个体微生物组成员与存活相关
作者通过在人源化小鼠中观察到的100个最丰富的OTUs的Cox模型分析微生物对生存期的影响。48个独特的OTUs被确定为与存活存在负相关或正相关（图6）。在这48个分类群中，22个与第0天和第7天的存活显著相关，21个仅在第0天相关（图6a），5个仅与第7天相关（图6b）。结果表明，特定微生物组成员的存在/不存在和相对丰度都会影响砷暴露期间的存活期。
图6 特定的微生物组OTU是存活的风险因素。数据集中最丰富的100个OTUs的存在/缺失符合单变量CPH模型
6. Faecalibacterium prausnitzii提供保护
在44只人源化小鼠中的36只微生物组中检测到Faecalibacterium OTU，存活建模（存在/不存在和丰度分析）确定该OTU在第0天和第7天与存活显著相关（图6）。为确定作者的砷毒性模型是否能够灵敏的检测单个细菌的影响，用最初从健康人分离的F. prausnitzii菌株A2-165对As3mt-KO小鼠进行了限菌实验。在一系列实验中，大肠杆菌菌株K-12（W3110）或B（BL21）的单一定殖的GF小鼠在25ppm iAsV暴露期间没有提供显著的保护。但是，E. coli–F. prausnitzii双定殖的存活显著增加（图7）。这些结果表明，F. prausnitzii至少部分地防护砷中毒，并且砷暴露的GF As3mt-KO模型对于检测这些效应是高度敏感的。
图7 F. prausnitzii防止砷中毒
结 论
哺乳动物细胞和许多微生物使砷解毒，但人体微生物组在解毒砷中的体内作用尚未得到解决。作者实验表明，微生物组扰动或缺失会增加宿主对砷的生物累积和毒性。此外，GF As3mt-KO小鼠是有用的高灵敏度的砷中毒模型，并且人类粪便移植恢复了这些小鼠的防护作用，此防护作用部分归因于微生物组的组成和稳定性，为人类微生物组可以防止砷中毒提供了第一个体内证据。最后，F. prausnitzii在人类砷暴露期间与微生物组稳定性有关联，并且在GF As3mt-KO鼠模型中起作用。需要进一步的研究来量化微生物可以酶促转化砷化合物和生物累积毒素这两种潜在的人体对砷的解毒重要机制的净影响。
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