科研 | Nature Microbiology: 古菌域新的烷烃厌氧代谢机理
编译：王寅炤，李留洋，编辑：小菌菌、江舜尧。
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以甲基辅酶M还原酶（MCR）为关键酶的产甲烷和甲烷厌氧氧化是古菌的基本代谢途径之一。而以MCR为基础的烷烃代谢在古菌域中分布如何以及如何进化至今仍是个谜。我们对来自全球不同环境基于宏基因组数据的MCR编码基因组进行了研究，获得了属于广古菌门中Archaeoglobi纲，Hadesarchaeota和不同的TACK超门古菌，包括 Nezhaarchaeota，Korarchaeota和Verstraetearchaeota的11个高质量的含有mcr基因的宏基因组组装古菌基因组，其中，属于Archaeoglobi纲的WYZ-LMO1和WYZ-LMO3 以及Korarchaeota的WYZ-LMO9同时编码产甲烷和硫酸盐异化还原的途经，代表着其具有在一个细胞内同时进行这两种途径的代谢潜能。HadesarchaeotaWYZ-LMO4–6和Archaeoglobi JdFR-42的基因组中编码与经典MCR差异较大的MCRs，这些酶有可能使其利用不同的多碳烷烃生存。本研究发现不同的古菌门类都存在着mcr基因，暗示着以MCR为基础的烷烃代谢是古菌域中普遍存在的一种代谢途径。
论文ID
原名：Expanding anaerobic alkane metabolism in thedomain of Archaea
译名：古菌域新的烷烃厌氧代谢机理
期刊：Nature Microbiology
IF：14.3
通讯作者：王风平&肖湘
作者单位：上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室、深部生命国际研究中心
实验设计
本论文研究不同环境下烷烃厌氧代谢古菌的分布和代谢途径。我们用McrA蛋白的代表性序列作为参考建立数据库，并以 Joint Genome Institute（JGI）宏基因组蛋白数据库查询筛选同源序列（identity >30%，e<10-20，coverage>75%）。经过筛选，共发现64个包含McrA序列的宏基因组数据集。随后从NCBI Sequence Read Archive（SRA）公共数据库下载这些数据集，重新组装、分箱和注释。
结果与讨论
宏基因组中检索到的McrA亚基的系统发育分析表明，它们与包括ANME-1，ANME-2a/b，ANME-2c，ANME-2d，ANME-3，Ca. Syntrophoarchaeum spp.和大多数已知产甲烷菌在内的广古菌门，以及非广古菌门 Verstraetearchaeota和 Bathyarchaeota亲缘关系较近。大多数与ANME同源的McrA序列与已知的McrA序列具有高度的一致性。而属于Verstraetearchaeota和Ca.Syntrophoarchaeum spp./Bathyarchaeota的近一半的McrA序列与已知序列的相似度分别低于80%和60%，表明这些序列来自未知的微生物。
从3个地热环境的宏基因组序列中，我们发现了11个高质量的含mcr的MAGs，它们包含不同的mcr基因。这些MAGs的完整度均高于80%，而污染度低于2%。利用这11个具有不同mcr基因的MAGs和从NCBI基因组数据库获得的参考古菌基因组构建了基于37个标记基因串联和16S rNRA基因的系统发育树（图1a,b）。通过这些分析得出，MAGs 属于Euryarchaeota，Hadesarchaeota，Korarchaeota，Verstraetearchaeota以及 TACK 古菌超门的一个分支。
图1 对12个MAGs的分类。（a）基于37个保守蛋白序列和来自4个古菌超门的233个代表性古菌基因组；（b）基于16S rRNA基因的MAGs与代表性古菌的亲缘关系。
其中三个MAGs与Archaeoglobi纲紧密聚集，临近Archaeoglobus fulgidus（图1a,b）。它们与亲缘关系最近的已培养Archaeoglobaceae菌株的全基因组平均氨基酸序列相似度（AAIs）为65%，16S rRNA基因序列相似度约为85-94%。三个 MAGs（WYZ-LMO4–6）聚到了Hadesarchaea 内，与MSBL-1古菌临近（图1a,b）。Hadesarchaea早先被视为是广古菌门下的一个分支，最近研究将其定义为一个独立的门Hadesarchaeota，可能在Asgard/TACK 的superphyla处分支。我们的研究发现，Hadesarchaeota分支于广古菌门。另外两个MAGs WYZ-LMO7和WYZ-LMO8尽管只有部分16S rRNA基因序列（~900 bp）与Crenarchaeota的Thermoprotei菌株有着约89%的相似度（图1b），它与全基因组最相近的Verstraetearchaeota，Geothermarchaeota和Crenarchaeota的参考基因组平均氨基酸含量相似度约为48–50%。此外，基因组蛋白序列和MCR编码序列与NCBI nr数据库已知蛋白序列相比都具有非常低的平均相似度（平均值<50%），说明这些MAGs可能代表新的烷烃代谢古菌谱系。虽然需要更多来自该谱系代表的基因组来确定其分类水平，但在这里，我们暂时将其命名为Nezhaarchaeota，Nezha即中国神话人物“哪吒”。MAG（WYZ-LMO9）与Korarchaeota紧密聚集，但是与Ca. Korarchaeum cryptofilum OPF8对比（图1a,b），只有~58%的AAI和~92% 16S rRNA 基因相似度，表明MAG WYZ-LMO9可能代表Korarchaeota门中一个新发现的科。两个 MAGs（WYZ-LMO10和WYZ-LMO11）归属于Verstraetearchaeota，但是只与已发表的Verstraetearchaeota基因组有着<65%的AAI，并且在系统发育树上距离较远。MAGs WYZ-LMO10和WYZ-LMO11之间显示了低的AAI（~65%），而且它们的基因组平均GC含量差异较大（WYZ-LMO10：50.3%；WYZ-LMO11：28.5%）。
我们的研究扩展了古菌域中已知mcr基因的分布，并确定了一些潜在的烷烃代谢古菌的其他谱系，包括广古菌门的Archaeoglobi、Hadesarchaeota和TACK古菌超门。三个亚基树状结构的高度相似清楚地表明了编码蛋白亚基的共同进化（图2）。基于系统发育分析，将MCR序列分为三组（I、II和III）。
Group I包含典型的MCRs序列，包括来自于序列（图2）。
Group II位于经典与高度分化MCRs之间，主要是TACK古菌超门的古菌序列，同时包含Archaeoglobi WYZ-LMO1–3的MCRs。
Group III代表着推测的多碳烷烃代谢MCRs，包含来源于Ca. Syntrophoarchaeum spp.，Bathyarchaeota， Hadesarchaeota和 Archaeoglobi MAG（Archaeoglobi JdFR-42，NCBI原核基因组数据库）的高度分化MCR序列。
图2 本研究中的12个古菌的McrA、McrB和McrG蛋白序列的系统发育关系。根据(a) McrA的461个比对位置；(b) McrB的351个比对位置和 (c) McrG的221个比对位置构建系统发育树
Archaeoglobi的 MAGs WYZ-LMO1–3包含Group II MCR的mcr基因以及完整的产甲烷途径（图3a,b），MAGs（WYZ-LMO1和WYZ-LMO3）另外拥有编码完整硫酸盐还原过程的通路，包括硫酸腺苷转移酶、硫酸腺苷还原酶（AprAB）和异化亚硫酸盐还原酶（DsrAB）的基因。我们还发现了编码DsrC蛋白和DsrMKJOP复合物的基因，它们通常存在于硫酸盐还原菌中。WYZ-LMO1和WYZ-LMO3的DsrA序列与厚壁菌门中的还原型DSR序列密切相关。许多Archaeoglobi可能在该谱系进化的早期就从细菌供体获得了dsrAB和aprAB基因，从而获得了进行异化硫酸盐还原的能力。几十年来，人们一直认为硫酸盐型甲烷氧化需要甲烷厌氧氧化古菌和硫酸盐还原细菌的共同作用。然而，基于本文阐述的基因组潜能，一些Archaeoglobi可能具有在单个细胞内进行硫酸盐型甲烷氧化的潜能。然而，我们不能排除这些Archaeoglobi也是产甲烷菌的可能性，尽管在它们的基因组中没有发现完整的氢化酶。Archaeoglobi MAGWYZ-LMO2 不包含dsrAB和aprAB基因。因此，作为烷烃氧化者，它需要一个电子受体合作者。然而，Archaeoglobi MAG WYZ-LMO2包含一个完整的Ni-Fe氢化酶基因集，类似于F420 -非还原型氢化酶（MvhADG）。这种酶通常存在于产甲烷菌中，通过消耗氢产生还原性铁氧化还原蛋白和还原性辅酶M（CoMSH）。因此， Archaeoglobi WYZ-LMO2可能是一种氢营养型产甲烷菌。当然，还需要代表性菌株的培养以证实这些基于Archaeoglobi基因组的假设。
令人惊讶的是，我们在NCBI基因组数据库中发现了一个包含两个高度不同的Group III mcr基因集的Archaeoglobi MAG（Archaeoglobi JdFR-42，图3c）。这两个mcr基因与Ca. Syntrophoarchaeum spp. 中的发现相似。在Ca. Syntrophoarchaeum spp.中，MCR复合物被证明可以活化多碳烷烃丙烷和正丁烷。此外，MAG JdFR-42编码了一条Wood-Ljungdahl通路和一条脂肪酸氧化通路，包括酰基辅酶A脱氢酶（FadE）、烯酰水合酶（FadB1）、3-羟基-辅酶A脱氢酶（FadB2）和乙酰辅酶A乙酰转移酶（AtoB）。这些通路与Ca. Syntrophoarchaeum spp.中发现的类似。因此我们认为，ArchaeoglobiJdFR-42是另一种多碳烷烃降解物。MAG JdFR-42不携带编码硫酸盐还原酶的基因，如dsrAB和aprAB。其基因组中含有编码硝酸盐还原酶/亚硝酸盐氧化还原酶（NarGHI）、周质硝酸盐还原酶（NapA）、硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白（NrtP）和类似于ANME-2d的固氮酶铁蛋白NifH的基因，因此可以利用硝酸盐/亚硝酸盐吸收电子。或者，如同Ca. Syntrophoarchaeum spp.一样，Archaeoglobi JdFR-42可能具有接受电子的共生细菌。
图3 具有未知mcr基因MAGs的烷烃代谢图。WYZ-LMO1和WYZ-LMO3（a）；WYZ-LMO2（b）；JdFR-42（c）；Hadesarchaeota WYZ-LMO4–6（d）；Nezhaarchaeota WYZ-LMO7（e）；Korarchaeota WYZ-LMO9（f）
HadesarchaeotaMAGs WYZ-LMO4，WYZ-LMO5和WYZ-LMO6（图3d）包含Group III 的mcr基因，这些基因与Ca. Syntrophoarchaeum spp./Bathyarchaeota的基因聚在一起。这三个MAGs都含有β-氧化途径，Wood-Ljungdahl通路，缺乏编码硫酸盐或硝酸盐还原的基因。已发表的MAGs Hadesarchaea（YNP_N21，YNP_45，DG-33和DG-33-1）不包含mcr基因，因此被认为可通过氧化一氧化碳和氢来固定二氧化碳。然而，本研究获得的Hadesarchaeota的基因序列表明，它们可能类似于Ca. Syntrophoarchaeum spp.氧化多碳烷烃。
NezhaarchaeotaMAGs WYZ-LMO7 和WYZ-LMO8（图3e）包含属于MCR Group II的 mcr基因。这些古菌还编码完整的产甲烷途径和两个氢化酶，辅酶F420氢化酶（FrhABDG）和依赖铁氧化还原蛋白的氢化酶（ECH），它们分别作用于辅酶F420和铁氧还蛋白的循环。MAGs WYZ-LMO7 和WYZ-LMO8包含类似于甲酸脱氢酶的基因，同时包含Fe-S簇的异二硫还原酶（HdrABC）。此外，两个hdrD基因位于类似琥珀酸脱氢酶的基因和含FAD/FMN的脱氢酶基因附近；这些酶可以用于将辅酶B 辅酶M（CoBS-SCoM）还原为还原性辅酶M和还原性辅酶B。因此，这些Nezhaarchaeota更可能是氢营养型产甲烷菌。
Korarchaeota MAGWYZ-LMO9也包含属于Group II的 mcr基因以及与厚壁菌门相关的亚硫酸盐还原酶（dsrAB）基因。如果编码的DSR酶复合物用于氧化方向，在硫化物转化为亚硫酸盐过程中释放的电子可用于从甲基生成甲烷。相反，DSR酶复合物用于还原方向亦是可能的，这时它将接受来自甲烷消耗的电子。MAG WYZ-LMO9缺乏产甲烷途径上游部分的基因，但编码甲基转移酶，如（甲基-Co（III）甲醇特异性钴蛋白）：辅酶M甲基转移酶（MtaA）、甲基硫醇：CoM甲基转移酶（MtsA）和甲胺-钴蛋白co-甲基转移酶（MtmB），这表明它可能使用甲基化合物生产甲烷，反之亦然。MAG WYZ-LMO9还包含编码用于再生CoMSH和CoBSH的HDR复合物的基因，并编码四组可能的氢化酶（MvhADG、FrhDG和两个假定的Ni-Fe氢化酶：NiFe-group-1g和NiFe-group-4b）。
VerstraetearchaeotaMAGs WYZ-LMO10和WYZLMO11也包含属于MCR Group II的 mcr基因。它们没有产甲烷途径的上游部分，但含有编码MtaA、MtsA和MtmB的基因，表明它们同样可能是产甲烷菌。MAGs WYZ-LMO10和WYZLMO11同样包含编码用于再生CoMSH和CoBSH的HDR复合物的基因，以及用于铁氧化还原蛋白回收的ECH复合物和能量转化氢化酶（EHB）。这些途径的结合可能使Verstraetearchaeota作为甲基营养型产甲烷菌生存，但它们需要一个如前所述可能是氢气分子的电子供体。
Euryarchaeota、Hadesarchaeota和不同分支的TACK古菌超门中已经证实存在编码MCR烷烃代谢的基因。我们对MCR复合体的三个亚基的系统发育分析表明，典型的广古菌MCR序列（Group I MCR）至少形成三个不同的单系簇。
（广古菌门-cluster I 包括 Methanobacteriales, Methanococcales和Methanopyrales；广古菌门- clusterII包括Methanocellales, Methanomicrobiales和Methanosarcinales;广古菌门-cluster III包括Methanomassiliicoccales, Arc I group (Methanofastidiosales),
Methanonatronarchaeia和ANME-1）
。Group II 的MCR在group I的旁边形成了一个单系簇，包含了来自TACK 古菌超门的MCR序列，同时还包含了Archaeoglobi MAGs WYZ-LMO1-3的MCR序列。除此之外，MCRs Group I和Group II的系统发育与全基因组和16S rRNA基因系统发育分析的拓扑结构一致（Figs. 1和2）。有两种情况可以解释在MCR Group II中出现的广古菌门Archaeoglobi McrABG序列。一种可能性是，广古菌门和TACK古菌的共同祖先已经包含了mcr基因簇，该基因簇被垂直转移到两个新出现的古菌超门中，这两个古菌超门就从那时起就独立进化了。在这种情况下，来自Archaeoglobi的古菌可能通过一个TACK 古菌的水平基因转移获得了Group II mcr基因。第二种情况是，TACK 古菌的一个祖先可能在两个超门分离后也获得了MCR，该可能来自含mcr的Archaeoglobi谱系。
MCRs Group III存在于不同的门，包括Euryarchaeota，Hadesarchaeota和Bathyarchaeota。具有这种MCR类型的具有较广泛的系统发育分布。然而，MCR Group III的McrA和McrG蛋白与MCR GroupII以及Group I的广古菌-cluster III MCR也有密切关系（图2a，c）。mcr基因Group III在不同古菌门中的分布的一个可能解释是水平基因转移，这使得一些以前最可能是产甲烷或甲烷氧化古菌成为多碳烷烃氧化者（图2a，c）。MCR与基因组GC含量、四核苷酸频率、密码子使用高度相似，这显示这种水平基因转移应该出现在这些生物进化的早期。未来研究需要从其他含mcr的代表菌株中获得基因组信息，以进一步评估mcr基因在古菌领域的广泛分布是否由于水平或垂直的基因转移机制，并确定最古老的含mcr的古菌。
结论
我们的研究提供了一个全球尺度烷烃厌氧代谢古菌的宏基因组多样性分析。尤其是针对地热环境样品，我们获得了包含mcr 的属于代表广古菌门Archaeoglobi，Hadesarchaeota，TACK古菌超门中的Korarchaeota，Nezhaarchaeota和最近报道的Verstraetearchaeota 的MAGs，发现它们可能进行（逆向）产甲烷和多碳烷烃氧化。同时我们提供了基因组证据，发现了在一个单独的Archaeoglobi 和Korarchaeota MAGs中甲烷代谢和硫还原基因的共存。这表明了古菌在全球碳平衡中起到极为重要的作用。然而，要验证本研究提出的代谢假说，还需要实验室培养上述代表菌株以及获得烷烃代谢古菌更多的基因组。
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