科研 | mSystems：植物宿主改变地下微生物群落以响应极端干旱
编译：王一，编辑：小菌菌、江舜尧。
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背景：气候变化导致全球降水和温度发生重大变化，预计在下个世纪将变得更加极端。微生物是生态系统中的重要成员，它们如何应对这些不断变化的非生物胁迫，对生态系统功能，营养物质的循环利用以及地上植物群落的健康生长具有重要意义。干旱胁迫对微生物活性会产生负面影响，但其影响幅度可能取决于地上和地下的相互作用。
方法优势与创新：以往实验性研究中的干旱处理通常是进行一次干旱处理，或多次干旱/再润湿处理，而没有考虑过进行干旱再润湿处理后，恢复灌溉后研究植物宿主代谢和微生物组的动态变化过程。该研究通过分析根部组织的代谢组学特征和地下特定细菌、古菌和真菌群落特征，揭示了极端的实验干旱处理以及随后的再润湿和恢复（即连续灌溉）过程中，多年生模式物种杨树（Populus trichocarpa）的宿主生理响应特征。
结果：植物代谢组学分析表明干旱胁迫增加了宿主对C和N代谢途径（氨基酸，脂肪酸，酚苷）的能量分配。几种代谢物与根系相关微生物α多样性呈正相关。与对照组相比，由于种植了杨树和干旱胁迫，干旱组的土壤细菌群落组成发生了显著改变，而土壤真菌群落组成仅随土壤中是否种植杨树而发生改变。且根真菌群落的改变与干旱胁迫相关性极强，而根细菌群落改变与干旱胁迫的相关性相对较弱。无植物组中细菌的水分胁迫机会性OTUs（指干旱处理特异富集的OTUs）的比例在干旱期末期很高（~11%），且高比例一直维持到再润湿期和恢复期，但在植物组中该OTUs的比例呈持续下降趋势。根系真菌的机会性OTUs在干旱组的恢复期比例较高（~17%），而在土壤样品中真菌机会性OTUs比例相对较低，特别是植物组中的土壤（＜0.5%）。结果表明，在极端干旱情况下，植物通过紧密的植物-微生物互作来调节土壤微生物与根相关微生物的干旱响应，但极端干旱后的响应模式随植物生境和微生物功能群的变化而变化。
论文ID
原名：Plant Hosts ModifyBelowground Microbial Community Response to Extreme Drought
译名：植物宿主改变地下微生物群落以响应极端干旱
期刊：mSystems
IF：6.1
发表时间：2020.05
通信作者：Allison M. Veach & Huaihai Chen
通信作者单位：橡树岭国家实验室
实验设计
1.处理组设置：
植物组：共80盆杨树插条盆栽，作为“植物组”
无植物组：10盆不种植植物的盆栽，作为“无植物组”
干旱组：对一半的植物组（n=40）和无植物组（n=5）进行干旱处理，作为“干旱组”
对照组：剩余一半的植物组（n=40）和无植物组（n=5）进行正常灌溉，作为“对照组”
2.采样时间点：（图1）
适应期：植物组和无植物组在盆栽中适应大约4周。
采样零点：适应期结束后，从植物组（n=5）和无植物组（n=5）中各收集5个重复样品，作为正式干旱试验开始的起点。
干旱期：干旱处理12天作为“干旱期”，干旱期结束后对各处理组（n=10）进行采样。
再润湿期：干旱处理12天后，对干旱组灌溉300mL去离子水，进入“再润湿期”，润湿24h，即第13天，对各处理组进行采样（n=5）。
恢复期：再润湿期后维持灌溉12天，这一阶段作为“恢复期”，12天恢复期后对各处理组进行采样（n=5）
3.采样方法：
收集5g根样品（直径约1毫米），并用去离子水冲洗，置于15 mL无菌管中，液氮速冻，-80°C保存，用于植物代谢组学分析。
剩余植物根连根带土置于50 ml无菌管中，置于冰上，从温室转移到实验室后-80°C保存。在进行菌群DNA提取前将根际土壤和根组织分离。用于根组织和根际土微生物群落分析。
用取土器（直径2.5厘米）对无植物组土壤进行采样，-80°C保存，用于无植物组土壤微生物群落分析。
图1 干旱处理组和灌溉对照组土壤持水量（GWC）的平均值±标准误（A），干旱期后出现的树叶枯萎，再润湿期，以及持续灌溉恢复期的树叶情况（B）。酚苷（C），氨基酸（D），脂肪酸（E）和糖醇（F）的植物代谢组学分析表明干旱后植物的代谢发生了显著变化。
结果
1 根代谢物表征
不同干旱处理组之间有多个代谢物群在浓度上有差异：干旱处理下植物根部合成了更多酚苷（图1C），氨基酸（图1D），脂肪酸（图1E）和糖醇（图1F）。氨基酸有显著的干旱处理-时期相关效应：干旱末期（第12天），产生的氨基酸平均浓度比对照组高110％；在再润湿期（第13天），干旱组和对照组中氨基酸浓度相似；在恢复期（第25天），干旱组的根比对照组合成了更多的氨基酸（图1D）。通过SIMPER分析鉴定出的39种代谢物中，有22种随不同时期变化，18种有显著的处理（干旱组，对照组）-时期（干旱期，再润湿期，恢复期）相关效应。值得注意的是，与对照组相比，干旱组三个时期的根部均富含氨基酸，丙氨酸，γ-氨基丁酸（GABA），甘氨酸，丝氨酸，亮氨酸和苏氨酸（P＜0.05）以及碳水化合物果糖，葡萄糖和棉子糖（P＜0.01），而柠檬酸却显著减少（P≤0.01）。有机酸中马来酸和琥珀酸仅在干旱组的干旱期有富集（P≤0.01）。
2 微生物α和β多样性
不同处理（P=0.02）和时期（干旱期、再润湿期、恢复期；P＜0.01）之间，土壤细菌/古菌系统发育多样性（PD）因有无植物有显著差异（P＜0.001）。土壤细菌/古菌分类学多样性（H’）仅在不同干旱处理之间有差异（P=0.005）。相对于植物组的土壤，无植物组土壤中菌群的PD平均升高了8%，而干旱组的PD和H’分别比对照组降低了5%和2%。土壤真菌H’仅随有无植物有差异（P＜0.001），相对于植物组土壤，无植物组土壤的平均真菌数量要高10%。与土壤微生物相反，干旱组与对照组相比，根细菌/古菌PD和H’分别增加了21%和12%（P=0.03和0.003），且根细菌/古菌PD在恢复期末期比再润湿期要高很多（P=0.04）。根真菌多样性并不随干旱处理和不同时期而发生变化（P≥0.08）。
细菌/古菌丰富度和多样性指数包括PD、H’，而真菌H’与植物组土壤中代谢功能群并不相关（P＞0.10）。然而，根的细菌/古菌PD和H’与糖类呈负相关，而PD与脂肪酸呈正相关，H’与氨基酸有关联。根真菌H’与氨基酸也呈正相关，与糖醇呈负相关。
对于土壤中的细菌/古菌群落结构差异，有无植物（无植物组vs植物组）解释了最大的差异（10%），不同时期（8%）和不同干旱处理（~5%）仅在较小比例上解释了差异。主效应之间的所有two-way相互作用都非常显著（表1）。植物组土壤中干旱组vs对照组的主效应略微影响了细菌/古菌群落结构。无植物组干旱组vs对照组在土壤群落结构上却有显著差异（图2A）。然而，直到恢复期结束，干旱组与对照组的微生物群落才显现出显著的转变。对于土壤真菌来讲，与细菌/古菌相比，有无植物解释了大概2倍的差异（~17%）。干旱处理没有显著影响土壤真菌群落结构，而不同时期解释了大概~4%的群落结构改变（表1；图2B）。土壤真菌群落中没有显著的two-way或three-way互作关系（P＞0.10）。根的细菌/古菌群落并不对干旱处理的主效应产生响应，但在不同处理和不同时期之间有轻微地显著互作（表1；图2C）。然而，事后FDR比较表明处理组×不同时期之间群落结构上无显著差异。根真菌群落对不同处理和不同时期均有响应（表1；图2D），且具有轻微地互作关系。与根细菌/古菌不同，在12天（干旱期）和25天（恢复期）干旱组和对照组的根真菌群落有显著差异，但在再润湿期无显著差异（表1）。
在土壤中，放线菌门、浮霉菌门、拟杆菌门和γ变形菌门随有无植物而不同（表2）：放线菌门、拟杆菌门和γ变形菌门在植物组中富集，而浮霉菌门和真菌的担子菌门、Mortierellomycota在无植物组中富集（图3）。放线菌门和厚壁菌门在不同处理组之间发生了转变，且存在有无植物×不同干旱处理的相关效应。在无植物组中，干旱处理分别增加了~40%和24%的放线菌门和厚壁菌门，而植物组中干旱对他们的丰度没有影响（图3A和B）。平均来看，不管有无植物存在，干旱组的酸杆菌门和绿弯菌门丰度均比对照组增加了大约1-2%（表2）。干旱处理后真菌子囊菌门平均增加了~8%。不考虑有无植物和不同时期的话，干旱组的δ变形菌门丰度比对照组下降了~11%（表2）。α和β变形菌门的丰度与干旱处理和不同时期显著相关。具体来讲，在干旱期和再润湿期，干旱组和对照组之间他们的相对丰度并没有改变，而无论有无植物，干旱处理都会在恢复期结束显著增加这些菌的相对丰度。在根内，干旱组相对于对照组平均分别增加了~22%和51%的α变形菌门和疣微菌门丰度，但没有不同干旱处理×不同时期的互作效应。球囊菌门丰度在干旱组（0.4%）中比对照组（1.2%）要低（P＜0.001）。
表1 将中心对数比转换应用于原始OTU数据后，使用欧式距离矩阵对细菌/古菌和真菌进行置换多元方差分析后的结果
图2 对土壤（C, D）和根（A, B）的细菌/古菌（A, C）和真菌（B, D）群落的PCA分析
表2 对有无植物、不同处理（干旱组和对照组）和不同时期（干旱期末期、再润湿期和恢复期）的优势细菌和真菌门类进行three-way ANOVA模型分析的结果
图3 干旱期、再润湿期和恢复期的无植物组土壤（A, D）、植物组土壤（B, E）和根内生（C, F）的优势细菌/古菌（A-C）和真菌（D-F）门分类水平的相对丰度。
3 干旱期/再润湿期/恢复期之间的差异丰度OTUs
无植物组土壤和植物组土壤在不同时期均具有敏感性（水分胁迫减少的OTUs，共304个）和机会性（水分胁迫富集的OTUs，共231个）的细菌/古菌OTUs（图4），而真菌中这样的OTUs均较少（敏感性共10个，机会性共4个）。在根内，仅有1个细菌机会性OTU，真菌中随时期变化却有4个敏感性OTUs和19个机会性OTUs。
在干旱期和再润湿期，细菌/古菌敏感性OTUs比机会性OTUs具有更强的响应性。然而，相比恢复期植物组的0.2%，无植物组出现了最大比例（~7%）的水分胁迫敏感性（差异减少的OTUs的总序列丰度）。这些恢复-敏感性OTUs包括大范围的泉古菌门、α-，β-，δ-和γ变形菌门、蓝藻门和浮霉菌门。
通常来讲，真菌敏感性很低，但在无植物组土壤中的恢复期却很高（3.9%），且敏感性真菌主要分类为Entomophthoromycota纲中的Basidiobolales，菌根Hebeloma sacchariolens和未鉴定的Rozellomycota。值得注意的是，真菌干旱敏感性的OTUs特征仍然是无植物组高于植物组，其中就包括未鉴定的Rozellomycota。根内有4个敏感性真菌OTUs，分别占~0.8%和1.4%的序列比例：2个在干旱期（主要是Hebeloma sacchariolens，其次是未鉴定的子囊菌门），2个在恢复期（主要是卷缘桩菇）。根的真菌敏感性OTUs在恢复期比机会性OTUs有更强的响应性（图5C）。
在恢复期植物组土壤中，细菌/古菌水分胁迫机会性OTUs比敏感性OTUs更具响应性（图4F），但机会性OTUs的丰度在干旱期末期的无植物组(11.5%)和植物组(12.4%)土壤中都是最高的（图4B）。然而，植物组土壤的干旱相关的机会性OTUs富集了更多酸杆菌门，而无植物组土壤富集了更多α变形菌门，放线菌门和芽单胞菌门。有趣的是，植物组土壤在干旱期之后，机会性细菌/古菌OTUs的比例下降（在再润湿期和恢复期为~2%），但在无植物组土壤中一直保持相对较高丰度（再润湿期~10%，恢复期8.8%）。在无植物组土壤的再润湿期中具代表性的机会性OTUs是β变形菌门，放线菌门和厚壁菌门，而在恢复期，大多数机会性OTUs属于β和α变形菌门。植物组再润湿期的机会性OTUs主要是酸杆菌门，而恢复期则是α变形菌门。
机会性真菌OTUs在无植物组土壤恢复期中丰度最高（1.4%），由腐生的Minimedusa polyspora组成。在干旱期和再润湿期，无植物组土壤中未发现机会性真菌OTUs，而在植物组土壤中各时期均有发现（干旱期0.8%。再润湿期0.3%，恢复期0.08%），虽然丰度很低，主要属于Hebeloma sacchariolens。在恢复期仅有一个机会性根细菌的OTU，属于蓝藻门YS2目。在干旱期和再润湿期，共有4个根真菌的OTUs，而恢复期则有11个（图5）。机会性真菌OTUs在干旱期末期比敏感性OTUs更具响应性（图5A）。在恢复期共有13个差异根的OTUs，主要是机会性OTUs。其中大部分丰度不高，且属于假定的病原类群，像链格孢属，木霉属，和Didymella glomerata。恢复期丰富的机会性OTUs主要属于子囊菌纲，间座壳目和炭角菌目。
结果
本研究中，我们发现即使经过恢复期，极端干旱仍导致植物生理特征改变（更多氨基酸，有机酸，和其他流入地下的代谢物群），而且特定植物代谢产物的相关变化可预示微生物多样性的变化，尤其是根系微生物。在植物组土壤中，干旱状况仅改变了细菌/古菌微生物组结构，而没有改变真菌群落结构，在根微生物组中情况却恰恰相反，根细菌/古菌受干旱影响较小。根真菌群落对干旱的响应比根细菌/古菌更敏感，但根际土壤中却并非如此。这些结果支持以下假设：土壤真菌具有耐旱性，且真菌群落在干旱胁迫下趋向于更稳定的状态，相反，在有植物输入或有生理宿主时，真菌才具有更强的响应性。数据表明，真菌对水分胁迫下植物的响应性更高，而在自身物理干旱情况（非生物作用）下响应性很低。这些趋势突显了在环境胁迫下，地下细菌和真菌群落非生物（水利用度）和生物（植物-微生物）相互作用存在差异的重要性。
1.植物宿主代谢应激和根微生物组
在12天的干旱期和之后的再润湿期，杨树树叶脱落严重，地下部氨基酸，脂肪酸，糖醇和酚苷的分配量增加（图1），这很可能是由于光合能力的衰退进而将更多能量投入根系生长。此外，指示水分胁迫的代谢物（例如5-氧代脯氨酸和果糖）在干旱期末期时被上调，而脯氨酸在恢复期末期时仍保持不变。尽管植物在干旱胁迫后确实可以存活并“恢复”过来，但干旱导致植物集中糖和氨基酸来缓解地下的胁迫反应，这可能会增加根系对水分的吸收。此外，细菌/古菌和真菌的分类学多样性均与根内氨基酸的积累呈正相关，这表明干旱胁迫可能影响地下微生物群落的定植动态。根的次级代谢产物以及其他根系分泌物（初级代谢产物）对干旱胁迫的响应随时间变化很大，这可能是通过微生物诱导的反应提升了宿主适应力。具体来讲，干旱胁迫下植物根部积累了更多有机酸或氨基酸之类的代谢产物，可能有助于招募特异益生菌促进植物生长。有益微生物可以促进特定分泌物分泌，渗透压形成，或生成过氧化物酶，从而消除水分胁迫产生的活性氧。由于根际土壤中更高的养分利用率，根际微生物组对根部功能变化做出的响应要弱于根内生菌的响应。为了支持我们的假设，我们没有找到根际微生物多样性与次生代谢产物合成之间存在关联的证据；因此，在水分胁迫期间，根际养分供应可能会改变植物宿主-微生物组的相互作用。
尽管土壤真菌在无植物组中对有无植物的响应比干旱处理要强（表1），但根真菌群落可能对植物宿主受胁迫有更强的响应。由于恢复期出现了一些包含假定植物病原的机会性OTUs，所以不能排除干旱和随后的恢复期期间可能会有病原体定植。尽管在恢复期这些植物病原丰度较低，但极端干旱可能会导致植物免疫力下降，进而给病原体更多的定植机会。
2.微生物从干旱到恢复：细菌和真菌的响应
在土壤干旱期末期，土壤细菌和古菌类群通常能长期抵抗水分胁迫，因为敏感性和机会性类群的相对丰度没有超过13%，并且在恢复期末期变得更为显著。在恢复期，植物组土壤有大约~2%的机会性类群，没有敏感性类群，无植物组这两种类群比例都要大很多（~6-8%）。由于细胞对干旱的敏感性是通过半透膜结构产生的，因此，土壤团聚体中的细菌类群更容易对水分波动产生响应。在干旱条件下，植物组和无植物组土壤中都富集了多种细菌门类（酸杆菌门、绿弯菌门、放线菌门、厚壁菌门）。同样，在干旱期末期中这些门类细菌中很大比例都属于机会性的，并在无植物组的恢复期末期始终维持着较高丰度，这表明了即使在广泛地系统发育群体中，也存在大量能够抵抗水分胁迫的类群。极强的外界干扰可对土壤细菌动态造成巨大影响，正如本研究中干旱处理和后续恢复期形成的α和β变形菌门主导的群落特征（表2）。这些可利用营养更丰富的细菌群可能在干旱胁迫中更具竞争优势，因为它们能够对环境变化做出更快的反应（即通过孢子进入休眠状态），并随着时间的推移逐步占据优势地位。结构-功能之间的关联性极其适用于研究驱动生物地球化学循环的微生物群落；因此，随着全球普遍干旱，这种研究趋势更具广泛的重要意义。此外，一旦缓解了水分胁迫，种植杨树可导致细菌结构改变，提升土壤细菌对极端干旱的抵抗力。当植物根系存在于土壤中时，可招募有益微生物，进而改变非生物胁迫响应；相对于无植物组土壤，根系分泌物实际上可以增加碳供应和水利用度，进而“保存”一些敏感性微生物群。
有趣的是，我们的数据表明，在干旱期，再润湿期和恢复期，根内生微生物（尤其是细菌和古菌OTUs）的丰度差异非常低，而根际微生物群中则变化很大。而其他研究则表明根相对于其他周围地下环境，是宿主微生物组中最具选择压力的生境。我们的结果表明，杨树的根微生物组可能对短期扰动更具抵抗力。此外，与其他植物宿主不同，杨树与根部细菌和真菌有复杂的互作关系，包括丛枝菌根和外生菌根的作用，这可能是与其他植物宿主的相关研究有差异的原因。此外，其他杨树微生物组研究显示根内微生物组具有高度变异性，并且由于16S rRNA扩增的弊端会导致重复序列丢失；因此，我们检测α和β多样性变化以及对差异丰度的统计准确度相对有限。
土壤真菌群落因种植杨树而显著改变，但不太受土壤极端干旱的影响，这一定程度上支持我们的假设。特定的真菌生活史和特征，例如低生长速率，细胞壁厚度和大量的渗透压生成物，可能允许对土壤中的短期水分胁迫事件具有更大的抵抗力。然而，干旱结束和恢复灌溉后，根群落因干旱处理发生了很大变化。事实上，外生菌根类群-担子菌类卷缘桩菇，在根水分胁迫敏感类群中占据很大比例，而球囊菌门在干旱处理中丰度较低。这些初步证据表明，极端干旱可能会导致真菌根系相关群落功能大幅翻转，并导致菌根种类减少。然而，在恢复期根部出现了相当比例的响应性机会性真菌类群，且属于各分类的真菌。这些趋势共同表明，干旱条件可能直接改变植物与真菌之间的互作，从而使潜在的益生真菌增殖。这在一定程度上支持了以下结果：在实验结束后的数周内对杨树个体进行监测，发现其地上部有显著的生长现象。
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