科研丨Nature：粘膜或全身微生物群的暴露可塑造免疫细胞库
编译：小范儿，编辑：小菌菌、江舜尧。
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微生物群的定殖引起B细胞的明显刺激和免疫球蛋白的诱导，许多类群定殖的哺乳动物具有高度复杂的免疫球蛋白库。文章使用一个简化的模型，即在无菌小鼠中进行短暂暴露不同微生物类群，解析微生物群如何塑造B细胞库及其功能反应性。通过深度测序，跟踪B细胞群和单细胞中免疫球蛋白库的发展。肠道粘膜微生物暴露的小鼠产生的寡克隆反应不同于无菌小鼠，也不同于微生物群全身暴露后产生的各种组成成分。在剂量增加后，IgA库(主要是细胞表面抗原)没有扩大，而增加全身暴露使IgG库扩大到微生物细胞质和细胞表面抗原。这些微生物暴露诱导B细胞中主要在记忆和浆细胞阶段的特征性免疫球蛋白重链库。顺序地全身性暴露于不同的微生物类群可使IgG种类多样化，并促进替代性特异性反应，而依次进行的粘膜暴露会产生有限的重叠库，并且会破坏初始IgA结合特异性。这显示对全身性暴露的灵活反应与避免致命性败血症的反应与对粘膜暴露的受限反应之间的对比，反映粘膜中宿主-微生物共生的一般性质。
论文ID
原名：Mucosal or systemicmicrobiota exposures shape the B cell repertoire
译名：粘膜或系统微生物群的暴露塑造B细胞库
期刊：Nature
IF：42.778
发表时间：2020.08
通讯作者：Stephanie C.Ganal-Vonarburg& Andrew J. Macpherson
作者单位：瑞士伯尔尼大学莫里斯·穆勒实验室(DBMR)
实验设计
使用标准化剂量的具有活性的大肠杆菌HA107菌株，短暂地暴露于无菌小鼠，主要通过肠道或血液两种方式。为了探讨免疫球蛋白重链类型的组成是否根据粘膜或全身微生物暴露而有所不同，根据暴露途径调查细菌-抗原结合的靶标。根据亚型、暴露途径和剂量，研究如何扩大或限制IgA或IgG种类，为了直接比较免疫球蛋白重链和轻链序列在不同部位的微生物暴露下如何在不同小鼠中进化，分析初代B细胞和转换类B细胞中成对重链和轻链的单细胞网络。最后探索IgA和IgG基因是如何在连续短暂接触不同微生物的情况下形成的。
结果
1不同的组成成分取决于暴露位点
使用标准化剂量活的大肠杆菌HA107菌株，短暂地暴露无于菌小鼠，主要通过肠道或血液两种方式。暴露后，由于HA107是必需细菌氨基酸D-丙氨酸和二氨基庚二酸的营养缺陷型菌株，所有小鼠均迅速恢复无菌状态。发现根据整个IgA，IgG和IgM组成部分的CDR3重链氨基酸同一性计算得出的不同抗体组成部分，具体取决于暴露条件（图1a–c）。不同暴露条件下的克隆型重叠不同（图1a-c右图），不同暴露条件在无监督树聚类中分离(图1a-c右图)。使用梭状芽胞杆菌作为第二个瞬时定殖的分类单元，以确认所有组成取决于微生物暴露的途径（图1d）。在对B细胞亚群进行标准化数量分析之前，流式细胞术分类显示，不同微生物暴露途径对记忆细胞和浆细胞产生不同的影响(图1e)。尽管与大量分析相比，单细胞实验目前仅捕获细胞类型库的一小部分，但结合重链和轻链信息的多维标度图发现也根据暴露途径进行分离（图1f）。随后的分析分别考虑单细胞重链和轻链细胞类型，表明微生物暴露途径的选择性作用与免疫球蛋白重链是分开的（图1g）。
图1在口腔或全身短暂接触共生微生物后，在粘膜和全身组织中的抗体库。
a–g，每隔一天，给无菌小鼠(GF)灌胃(i.g)或静脉注射(i.v)三次大肠杆菌HA107 (a-c, e-g)或梭状芽孢杆菌(d)并与无菌对照组小鼠进行比较。对回肠、肠系膜淋巴结(MLN)、骨髓(BM)和脾脏的IgA(a, d)、IgG2b (b)和IgM (c)免疫球蛋白序列进行测定。在a-d中，左侧的面板显示基于免疫球蛋白重链CDR3氨基酸序列的多维标度(MDS)图。在a–d中，右侧面板显示不同启动条件或相同启动条件（不包括来自同一只小鼠的样品比较）样品之间定殖重叠的Tukey图。e，21天时指示的分选B细胞群的IgM，IgA和IgG2b。f，基于结合的免疫球蛋白重链和轻链CDR3氨基酸序列的库之间距离的MDS图。g，肠系膜淋巴结和脾脏的单细胞重链或轻链免疫球蛋白库的分层聚类。
2 暴露途径影响B细胞靶向
为了探讨免疫球蛋白重链类型的组成是否根据粘膜或全身微生物暴露而有所不同，根据暴露途径调查细菌-抗原结合的靶标。肠道内的IgA能最有效地结合大肠杆菌纯化的细菌膜部分，而血清中IgG能同时结合细胞膜和细胞质部分(图2a)。大肠杆菌的核糖体蛋白在血清IgG抗体的细胞质结合中占主导地位，并在第二种情况下通过蛋白质组学分析在全身暴露于肠杆菌的无特定病原体的小鼠中得到证实。表明与全身治疗后的脾脏相比，脂多糖/16S核糖体比例更高，表明相对于肠系膜淋巴结内的细胞质内容物，细菌膜暴露增加。这些差异可能与肠道内细菌脂质吸收效率与细菌细胞质蛋白含量有关，而全身性暴露在调理和吞噬作用后，会对膜和细胞质部分产生等效的免疫应答。支持这一证据，超声波裂解与完整细菌全身性暴露的B细胞类型库重叠。所以，从粘膜和全身性引发的不同B细胞库是微生物膜和细胞质抗原在不同的解剖区被处理和呈现。
图2全身或粘膜暴露后B细胞库之间的差异。
a，全身或肠道抗体（左，血清IgG2b；右，肠道洗液IgA）与大肠杆菌膜的结合。b，肠系膜淋巴结和脾脏中IgA（左）和IgG2b（右）在21 d时免疫球蛋白重链测序的反射图。c，肠系膜淋巴结（左）和脾脏（左插图）中IgA在21天免疫球蛋白重链测序，脾脏（右）和肠系膜淋巴结（右插图）中IgG2b免疫球蛋白重链测序。d，在21 d时，脾脏分选的B细胞群的IgM（左），IgG2b（中）和IgA（右）重链测序，每种情况下，n = 6只小鼠。e，f，单细胞测序分析。。
3 暴露环境决定IgA或IgG的多样性
以前发现IgA是寡克隆的。接下来根据亚型、暴露途径和剂量，研究如何扩大或限制种类。全身暴露后，IgG多样性普遍显著增加，而最大粘膜暴露后，任何组织中均未发现IgA多样性增加(图2b)，且IgG和IgA的多样性均显著低于IgM。随着粘膜暴露剂量的增加，IgA重链中CDR3克隆型的多样性变得更加受限，尤其是在肠系膜淋巴结中(图2c)。相比之下，脾脏和肠系膜淋巴结中IgG重链的多样性在较高的全身暴露水平下得以维持或进一步增加(图2c)。在已分选的细胞中证实，全身微生物暴露后，IgG记忆和浆细胞种类多样性增加，而两种暴露方式都没有增加IgA浆细胞(图2d)。粘膜和全身暴露在上皮屏障和局部抗原处理和呈递到B细胞的可伸缩性方面显然有不同的物理限制。然而，我们的实验表明，粘膜微生物剂量的增加只会使IgA抗体库变窄，而全身性IgG库则随着暴露剂量的增加而逐渐多样化。
为了直接比较免疫球蛋白重链和轻链序列在不同部位的微生物暴露下如何在不同小鼠中进化，分析初代B细胞和转换类B细胞中成对重链和轻链的单细胞网络。如图1g, 2e, f所示，轻链多样性对网络的贡献很小。肠暴露后肠系膜淋巴结内的IgA主要显示重链连接(包括无菌小鼠和粘膜刺激小鼠之间的连接)，而系统性暴露小鼠脾脏的IgG网络中与无菌小鼠相同的序列很少(图2e, f)。我们的结论是，暴露于不同微生物的小鼠之间的肠系膜淋巴结和脾脏有明显的类转换免疫球蛋白序列关系。表明处于粘膜暴露特征的发育中的IgA抗体序列与无菌小鼠中出现的类转换免疫球蛋白序列有关。
4 全身反应的口服敏性
口服可溶性蛋白抗原可耐受随后的B细胞和T细胞对相同抗原的全身暴露反应。相比之下，与单独肠道暴露相比，微生物粘膜暴露之后的全身暴露将系统反应的阈值降低几个数量级(图3a)。这种作用是T细胞依赖性的，这一事实表明，在初次肠道暴露时，可通过CD4 T细胞耗竭来消除增强的全身反应。尽管先前通过粘膜暴露于同一微生物会引起全身反应，但这并没有奏效。全身性暴露并未降低随后由粘膜途径引发的粘膜IgA反应的高阈值（图3b）。
图3粘膜和全身暴露或暴露于两种不同的微生物类群后的抗菌抗体反应。
a、b、无菌小鼠在肠道(a)或系统(b)隔天暴露于大肠杆菌HA107，或始终保持无菌状态。流式细胞术分析42天血清IgG2b (a)或肠道IgA(b)的特异性细菌结合。C、如a、b所示，对无菌小鼠进行免疫球蛋白测序，以筛选脾脏浆细胞的IgM。d, e，细菌流式细胞术检测大肠杆菌-HA107特异性（d）或鼠伤寒沙门氏菌-HA218特异性（e）肠道IgA。f，脾脏(右)和肠系膜淋巴结(左)IgA基因库中扩增类型的平均基因多样性和中位数百分比的比较。g，全长IgA重链序列的层次聚类。h–k，实验设计与d–g相同，只是系统地给出了两个可逆分类单元。h, i，细菌流式细胞术检测血清IgG细菌结合。j，脾脏（右）和肠系膜淋巴结（左）的IgG2b组成部分中平均组成部分多样性和扩展克隆型的中位数百分比的比较。k，全长IgG2b重链序列的层次聚类。f，j，对扩增的克隆型的数量进行不成对的两尾t检验。
5 连续暴露的功能效应
最后一个问题，IgA和IgG库在连续短暂接触不同微生物的情况下是如何形成的。粘膜暴露非复制型鼠伤寒沙门氏菌菌株HA218可减弱已建立的对大肠杆菌HA107的粘膜IgA反应，反之亦然（图3d，e）。相比之下，无论暴露顺序如何，全身暴露任何一种微生物所引起的更广泛全身性IgG反应都不受限制（图3h，i）。CDR3克隆型的序列也受到最近的粘膜暴露的影响，然而，在连续的全身暴露后，无论暴露顺序如何，抗体库都不同(图3g, k)。免疫球蛋白(IgA)的克隆亲缘性和克隆多样性在连续治疗后均无显著增加，而在连续全身治疗后脾脏的IgG克隆亲缘性和克隆多样性有所增加(图3f, j)。这些结果与新的全身性IgG特异性更大的灵活性相适应，以适应对另一种微生物的反应，而IgA粘膜保护需要更通用的（可能更低）亲和力反应，以适应多种不同的重叠抗原暴露。
6 总结
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