编译：厚朴，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
丛枝菌根真菌（AMF）与大多数陆地植物根共生，以无机养分作为交换获取光合产物。基于贸易伙伴关系经济学的生态学理论预测营养丰富会抑制AMF。然而，来源于氮（N）和磷（P）添加的实验的结果是高度可变的，并且潜在的机理仍然不清楚。本研究展示了在蒙古草原上，长期N和P添加梯度的实验发现AMF对土壤N:P化学计量操作存在不同的响应。一个带有不同酸添加梯度的补充实验从氮的养分中区分了氮引起的酸化效应。在两种优势的寄主植物物种中AMF根的定殖和外生的真菌生物量沿着P添加梯度减少，表明C和P的权衡。相反地，低到中等的N输入增加了AMF的各参数，响应了增加的NP比。然而，高N输入减少了AMF的定殖和生物量，并且N引起的抑制作用的量级与酸添加实验中引起的相似。结构方程模型进一步表明，虽然土壤NP化学计量在P添加下主要控制着AMF，但是N引起的土壤酸化在高氮输入下超过了NP化学计量比的作用，主导了活性氮对AMF的作用。此外，根中的AMF群落组成更依赖于寄主植物并且对土壤养分的变化没有响应。本研究进一步提出了一个综合的框架，综合考虑了活性氮和磷输入对AMF的生物和地球化学效应。总之，这些结果表明尽管C-P之间的权衡控制着P对AMF的抑制，但是氮引起的酸化是氮抑制作用的主导因素。本研究的结果表明将N和P输入的地球化学影响结合起来，将有助于模拟菌根对植物相互作用和土壤碳平衡的影响。
原名：Nitrogen-induced acidification, not N-nutrient, dominates suppressive N effects on arbuscular mycorrhizal fungi
译名：氮引起的酸化而不是养分主要抑制了丛枝菌根真菌
期刊：Global Change Biology
IF：8.555
发表时间：2020
通讯作者：白永飞，张艺，胡水金
作者单位：中国科学院植物研究所，南京农业大学，北卡罗莱纳州立大学
活性N和P对AMF根定殖，外生菌丝和群落组成的影响的概念框架。
黑色箭头：正向影响；红色箭头：负向影响；虚线箭头：不确定的影响。
本研究在位于中国，内蒙古，锡林河旁的中国科学院内蒙古草地生态研究站的典型草原生态系统开展。土壤中的有效N和P很低，并且AMF可能在植物养分吸收方面扮演着重要的角色。两种主要的植物物种，大籽蒿和羊草，随着N的输入显著增加，但是随着P梯度的增加几乎保持不变（Bai et al.,2010）。
N和P实验都建立于1999年的秋季。N添加实验创建了多个N添加梯度，并且没有P和其它养分的限制，每个区组包括6个N添加水平，在生长季中（7月1-5），氮以硝酸铵肥料的形式添加。为了确保N是唯一的限制养分，在所有的处理样方中也添加了P，S和微量元素。P添加实验为了创建P梯度，并且不受N和其它养分的限制。包括6个P水平。为了确保P是唯一的限制元素，在所有的处理中也添加了等量的N和等量的S以及微量元素。为了评估潜在的土壤酸化对AMF的直接影响，建立了酸添加实验，有7个酸添加水平：0,2.76,5.52,8.28,11.04,13.80和16.56 mol H+ m-2。酸添加在2009年9月初，2010年7月初和2010年9月初实施。
在2013年8月，在N和P添加实验中，随机选择了3个区组进行AMF的分析。选择了5个N添加水平（被设定为N0，N18，N53，N105和N280）和P添加水平（被设定为P0，P20，P40，P80和P320）。对于酸添加实验，土壤和根样品采集于2019年8月。选择了5个处理（0，2.76，5.52，11.04和16.56 mol H+ m-2）4个重复，被设定为A0，A2.76，A5.52，A11.04和A16.56。酸添加实验中土壤pH的结果与N添加实验中的土壤pH的范围很吻合。
在N和P添加的实验中收集每个样方中（1.0m ╳ 0.5m）地上生物量。两种优势植物，大籽蒿和羊草被选择作为模式寄主植物研究他们相关联的AMF。在每个样方中随机的选取每种植物物种的两个点。植物齐土壤表面剪，每个样地将每种植物的根混合形成复合根样。从每个样方收集的土壤混合成一份土壤样品。
对于采集的土壤样品，测定了土壤含水量，总N和P，可提取的土壤铵态氮和硝态氮以及有效P。根经台盼蓝染色后，用网格线交叉法对菌根定殖进行显微镜观察。通过定量AMF生物标志物，即标志性磷脂脂肪酸（PLFA）（即16:1ω5c）来测定外源性AMF生物量。对野外采集的植物根部的土壤进行丛枝菌根真菌DNA的提取。然后进行高通量测序分析。
使用单因素方差分析以及Tukey’s检验分析养分添加对响应变量（AMF定殖，外生的真菌生物量，植物生物量和土壤化学参数）的影响。线性回归用来检验AMF和土壤参数之间的关系。结构方程模型（SEM）用于进一步分析不同的因袭对AMF影响的相对大小，数据使用最大似然法拟合和χ2检验。
原始的土壤的pH值为7.3（表1）。在14年的处理后，N和P添加显著降低了土壤pH，但是减少的量级显著不同。土壤pH从对照处理的（N0）6.9到最高N输入（N280）的4.6，显著减少了2.3个单位。相反地，土壤pH从不添加P的对照（P0）中的6.5减少到最高（P320）添加下的6.1（表1）。值得注意的是，原始土壤中土壤pH的减少伴随着N和P肥的实验效应，因为N和微量养分添加确保所有的N处理有相同的P和微量元素量。然而在P0处理中连续添加2.4 g N m-2 yr-1使得土壤pH从7.3减少到6.5，在N0中添加10g P2O5 m-2 yr-1土壤pH减少到6.9（表1）。氮添加不显著影响土壤总N，有效P或者土壤TN和TP的比值，尽管在N280添加下CN比显著减少。相反地，高P输入显著增加了土壤总P，并且降低了TN和TP的比值，尽管它们没有显著影响土壤总C，土壤总N或者CN比。土壤总P显著增加，但是总N没有，表明土壤中P的积累，但是N由于淋溶和气体损失很难再土壤中保留。土壤有效N和P在没有养分添加的原始土壤中（CK）非常低（每千克土壤中含0.6 mg NH4+-N，14.2 mg NO3--N和3.2 mg有效P，表1）。在N添加的实验中，NH4+-N，NO3--N以及它们的联合（这里指的是有效N）沿着N输入梯度显著增加。在所有的N处理样方中P的添加（10 g P2O5 m-2yr-1）导致有效P的平均值为40 mg kg-1。这些结果表明土壤P得到有效的调控，并且在所有的N样方中均匀分布。最终，相对有效的NP比梯度被创造，从0.5到3.6，作为有效N和有效P的比值（表1；图1a和2a）。此外，有效氮在N280时异常高，为138.4mg kg-1，并且NH4+-N的含量为36.6 mg kg-1（表1），这在高N输入的农业土壤中很少见。土壤中高的铵根也表明土壤酸化可能部分抑制了氨氧化微生物的活性和硝化过程（Ye et al., 2018）。在P添加的实验中，沿着P添加梯度，有效P从3.1增加到74.4 mg kg-1。与此同时，每年添加2.4 g N m-2的氮会导致所有的P处理样方中有效N大约为40 mg N kg-1，表明N添加时有效并且均匀分布的。NP有效性的相对梯度为13到0.6（表1；图1c和2c）。地上植物生物量在N0中非常低，大约是90 g m-2。在氮的实验中，地上和地下生物量都沿着N添加梯度增加，但是地上相对于地下增加的量级更高。在N的实验中，相对于N0处理，在2.4 g N m-2的N添加下，在所有的P处理中，生物量大约增加约43%。然而，对于地上植物生物量没有显著的P效应，并且在所有的P处理中，生物量没有显著差异，表明P添加没有进一步促进植物生长。在原始土壤中（CK）大籽蒿和羊草根中的AMF定殖的平均值分别是65%和70%。在N实验中，P和微量元素的添加的N0处理中大籽蒿和羊草的AMF感染率分别是59%和50%（图1a）。在P实验中，N（2.4 g N m-2 y-1）和微量元素添加在P0处理中倾向于增加两种寄主植物的AMF定殖（在大籽蒿中为69%，在羊草中为83%）（图1c）。在N添加实验中，低到中度N添加对羊草的根的AMF定殖有正向影响：AMF定殖速率从N0中的50%，在N18，N53，和N105中分别增加到75%，63%和65%（图1b），但是在高N输入下减少到33%（图1a）。大籽蒿AMF定殖速率在低N（N18和N53）输入下没有统计变化，但是在高N（N105和N280）输入下显著减少。然而，在P添加实验中结果明显不同：在两种寄主植物中，AMF定殖速率沿着P梯度逐渐降低（图1c，d）。AMF定殖速率，对于羊草，从P0中的83%减少到P320中的41%，对于大籽蒿，从69%减少到24%（图1c）。此外，大籽蒿相对于羊草其AMF的定殖速率对N或者P的输入响应更大。
图1 N添加（a,b）和P（c,d）添加对大籽蒿和羊草根的AMF定殖速率和土壤中有效NP比的影响。a, 5个N添加水平：0,17.5,52.5,105和280 kg N ha-1 y-1; b, 4个N添加水平：0,17.5,52.5和105 kg N ha-1 y-1；c,5个P添加水平：0,20,40,80和320 kg P2O5 ha-1 y-1;和d，4个P添加水平：0,20,40和80 kg P2O5 ha-1 y-1。最高的N或者P输入处理分别从b和d样方中移除，为了更好的强调没有土壤化学影响（例如，土壤pH）时，养分添加的影响。相对于AMF定殖，N和P添加对AMF生物量有相反的影响，这一结果是很振奋人心的（图2）。对于两种寄主植物，除了在最高的N处理下，AMF生物量沿着N输入梯度增加（图2b）。两种寄主植物在任何N水平下的AMF生物量没有显著差异，在N18，N53和N105处理中AMF生物量的平均值分别增加了14%，70%和48%（图2b），但是在N280处理中减少了43%（图 2a）。相反的，沿着P添加梯度AMF生物量逐渐减少，并且在两种植物物种之间有几乎可以区分的格局和量级（图2c,d）。相对于P0，AMF生物量在P40，P80和P320处理中分别减少了29%，45%和75%（图2c）。
图2 N添加和P添加对大籽蒿和羊草外生的AMF生物量和土壤有效的NP比的影响。N和P添加速率与图1中的一致。5 AMF定殖速率和外生菌丝对有效的土壤N，P和NP化学计量变化的响应因为N对AMF的影响在最高的N输入和其他的N处理之间有显著差异（图1a,b和2a,b），本研究在两种不同的情形下检测了AMF参数和养分参数之间的关系：有和没有最高N输入（N280）。当最高的N输入排除时，土壤有效N或者NP比与AMF定殖速率不显著相关，除了在大籽蒿中。然而，有效的土壤N或者NP比倾向于与外生的AMF生物量正相关，尽管这种相关仅仅在大籽蒿中显著。然而，包含N280处理时完全改变了AMF参数（即，克隆速率和外生的生物量）和养分指标（即，有效的土壤N和NP比）。结果是，养分指标与AMF参数负相关，表明数据严重偏向于N280。P输入对AMF的影响在这些N输入下显著不同（图1和2）。AMF定殖和外生菌丝生物量在两种寄主植物中，随着P输入，土壤有效P和PN比的增加而降低，不管最高的P输入是否包含在内。6 在N添加和P添加实验中AMF定殖速率和外生的菌丝生物量的控制因子最优的SEM模型暗示着本研究的数据支持土壤养分变量和AMF定殖速率和外生的菌丝生物量之间大多数的联系（图3）。尤其是，合适的模型包含N280和不包含N280显著不同（图3a,b）。当N280去除时，土壤N的有效性直接解释了土壤NP比91%的变异，并且NP比结果的变化是AMF生物量最合适的预测因子（R2=16%）。当N280包含在内时，N添加导致的土壤pH的减少是AMF生物量最合适的预测因子，并且N的有效性是AMF定殖最合适的预测因子。这些发现在很大程度上与简单的线性回归结果一致，并且表明N添加引起的土壤酸化直接影响AMF菌丝生长。高的有效N对AMF定殖有负向影响，可能是由于NH4+的毒害效应。在P的实验中，土壤P的有效性解释了土壤PN比99%的变异。有效P是AMF定殖速率最优的预测因子，并且土壤PN比与AMF生物量相关性很强，对于两种丛枝菌根变量分别能解释47%和72%的变异（图3）。两种不同的情形，P320包含或者不包含，评估了最高的P输入是否偏斜了有效P和土壤NP比对AMF的影响。有趣的是，在两种情形下出现的最优的SEM模型是可识别的，对于AMF定殖，有效P是最优的预测因子，对于AMF生物量土壤PN比是最优的预测因子（图3c,d）。仅仅的差别在与当模型有5个P水平时比只有4个P水平时，有较高的AMF定殖速率和AMF生物量的变异解释度。
图3 结构方程模型（SEM）分析了N添加（a，5个N添加水平；b，4个N添加水平）和P添加（c，5个P添加水平；d，4个P添加水平）对根的AMF定殖速率和外生的AMF生物量的影响。箭头上的数字是标准化的路径系数。实线代表显著的关系，虚线代表不显著的关系。黑色箭头代表显著的正向相关关系，红色箭头代表显著的负向相关关系（P<0.05）。此外，响应变量旁的R2值代表被其它变量所能解释的比例。相对于外生的AMF菌丝生物量和根定殖速率，植物根中的AMF群落对N或者P的输入相对不敏感。在所有的处理中，总共有137个OTUs属于6个科。总而言之，在两种寄主植物中，中等剂量的N输入倾向于增加AMF OTU的丰富度，然而OTU丰富度在最高剂量的N输入下较低（图4a）。相反地，P对AMF OTU丰富度的影响更多变：在最高P输入下，在两种寄主植物中OTU的丰富度都减少，对于羊草而不是大籽蒿，OTU丰富度沿着P梯度呈下降的趋势（图4b）。在两种寄主植物中都能观测到N和P对优势的AMF分类单元有对立的影响：在大籽蒿中，在高N或者高P的输入下，Glomeraceae的相对丰度倾向于更低，Diversisporaceae的相对丰度倾向于更高。这些结果表明寄主的身份相对于土壤养分状态在形成土壤的AMF群落组成中起着更重要的作用。
图4 N添加（a）和P添加（b）对大籽蒿和羊草根中AMF群落OTU丰富度的影响。8 酸添加对土壤pH，N和P含量，AMF定殖速率和外生的生物量的影响在酸添加实验中，沿着酸添加梯度土壤pH显著降低，从7.3到4.8，降低了2.5个单位（表2）。酸添加显著减少了土壤中硝态氮含量，但是增加了土壤中铵态氮含量，从而导致总的有效氮没有显著变化。土壤总N，总P，TC和TN比以及TN和TP比不受酸添加的影响，尽管土壤总C在最高的酸添加下显著降低。酸添加增加了土壤有效P，导致NP比沿着酸添加梯度显著降低（表2）。在没有酸添加时，羊草中AMF的定殖高于大籽蒿根中的定殖（图5a）。在最高的酸添加下AMF定殖速率减少近乎35%（图5a）。外生的AMF生物量在两种寄主植物中沿着酸添加梯度减少，几乎减少到了与最高酸添加下的值（图5b）。随着土壤有效NP比的增加，AMF定殖速率和外生的真菌生物量显著降低，这可能是由于减少的土壤pH，而不是养分的抑制，因为有效的N或者P的量仍然低（表2）。
图5 酸添加对大籽蒿和羊草根的AMF定制速率（a），大籽蒿和羊草外生的AMF生物量（b）和土壤有效NP比（a, b）的影响。
N和P添加对AMF的影响不同，低到中度的N添加促进AMF，低到中度的P抑制AMF（图1和2）。这些差异首先源于寄主植物导致的N或者P吸收的差异，也源于他们对土壤地理化学的影响不同（图6）。AMF的生长和养分运输是高能量消耗的，因为植物分配了较高比例的光合产物（超过20%）给AMF。菌根植物发展了两种途径进行养分的获取：通过他们的根毛和表皮细胞直接吸收，和通过AMF间接获取（即菌根的途径）。然而，AMF途径赋予了植物在非常低的含量时通过增加吸收面积获取养分，当有效养分高时，根途径是很有效的。基于土壤养分有效性，寄主植物能调节哪种途径活跃。AMF有利于植物P的吸收，通过诱导磷酸转运基因的表达，高磷处理可抑制丛枝特异性磷酸转运体基因的表达。与此同时，对于植物土壤pH和P的有效性存在紧密的联系。经典的观点来看，在土壤pH 6.5左右，可溶性P最大，伴随着最低的P固定（通过钙，铝和铁的矿化）。在本研究中沿着P梯度，AMF侵染和生物量的减少表明寄主植物能迅速感知磷的有效性增加，并在根真菌界面调节碳的分配，以优化寄主效益。
N对AMF在分子水平上类似的负反馈机理还没有确定。然而，N的输入增加了N的相对有效性并且导致P的缺乏，刺激产生的分泌物，触发AMF孢子萌发和菌丝分枝。氮添加梯度的实验表明，土壤中AMF随N:P比的增加而增加，这在我们的研究中也得到了证实。先前对五个草原的综合研究表明，在磷限制的土壤中，长期输入100-150 kg N ha-1y-1仍能提高AMF的生产力、物种丰富度和多样性。
N输入对植物生长的促进通常增加了植物对其它养分和水的获取，可能会促进地下根和AMF的植物C分配。有证据表明N沉降通常增加了AM植物的初级生产力并且通过支持AM植物超过外生菌根植物物种从而改变植物群落。此外，AMF菌丝是N丰富的，在N限制的条件下可能会与寄主植物竞争N。高氮利用率的氮投入可以促进丛枝菌根真菌氮素的转移，增加植物对丛枝菌根真菌的投资效益。当考虑N和P对AMF的影响时，AMF在植物水分吸收和作为共同限制因子的影响通常被忽略。尽管本研究没有考虑水分的影响，但是内蒙古草地，如其它许多干旱和半干旱系统一样，受N和水的有效性共同限制。野外研究也表明改变水分有效性对AMF群落的影响大于N输入的影响。总之，这些结果表明N输入会产生正反馈，AMF增加的N吸收会促进植物C分配到AMF，用于吸收其它资源。
这种正反馈会一直维持直到植物和AMF生长的主要限制因子转变。地上对于光和空间的竞争会减少植物C的分配，在本研究中也发现了随着N输入的增加，茎根比减少。高N输入引起土壤酸化和氨的积累，会显著限制植物和AMF的生长。不过，大多数研究不能从N的影响中剥离出pH的影响。本研究的酸添加实验提供了直接的证据，来自于N添加的土壤酸化能诱导相当的AMF根定殖和外生生物量的抑制。
本研究的结果再一次确定了外生菌丝和AMF根的定殖相对于AMF群落组成对养分输入更敏感（图1，2和4）。然而，值得注意的是土壤中高N有效性可能会改变AMF群落，支持N耐受的类群，但是具有低的外生菌丝对寄主的P效益较少。本研究的结果表明两种寄主植物的菌根根际土壤的外生的AMF生物随着N输入的增加而增加，除了最高的N处理（图2b）。然而，N输入对根的AMF群落影响是有分歧的，随着N的输入在大籽蒿中增加了Glomeraceae，但是在羊草中减少了。这些结果表明AMF群落组成更多的依赖于寄主植物并且相对于外生的菌丝生物量对土壤N，P和NP比的变化的敏感性较弱（图6）。
本研究首次阐明了长期的野外试验中土壤NP化学计量比对AMF的影响。排除了共同限制的养分，使我们能够直接评估N或者P对植物和AMF的影响，并且酸添加实验帮助我们区分N-营养和N引起的酸化效应对AMF的影响。基于本研究的结果以及之前文献研究的发现，本研究提出了一个概念框架，将生物和地球化学过程结合起来，从机理上理解氮和氮对AMF的富集作用（图6）。本研究的结果表明土壤NP化学计量比是AMF定殖和外生的菌丝生长的主要控制因子，然而N引起的酸化可能在高N输入时会战胜这些养分效应（图6）。这些发现表明低或者中度的N输入可能会促进丛枝菌根真菌并且增强AMF对植物养分获取的调节作用。因为化学氮的输入通常会抑制外生菌根真菌，我们的研究结果支持了这样一个假设：在未来气候变化情景下，AMF的增氮可能会改变森林中丛枝菌根和外生菌根植物物种的植物相互作用和土壤碳动态。
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