细胞基因编辑有哪些应用？

CRISPR-Cas9系统作为易于使用且功能强大的基因编辑工具，在疾病基础研究、靶点验证、药物分子的高通量筛选、以及遗传性疾病的治疗等领域得到了越来越广泛的应用。其中，运用CRISPR-Cas9构建基因敲除（KO）细胞的技术日愈成熟。那么，KO细胞除了用于常见的基因功能研究还有哪些应用？KO细胞能为我们解决什么研究问题呢？

疾病发病机制研究

在研究某种疾病发生机制时，基因功能（靶点）的研究是其中的关键。基因功能的体外研究常需要用到目的基因表达调控的细胞模型，如进行基因过表达或敲低表达，从而实现目的基因的gain of function和loss of function。虽然基因干扰技术用于基因loss of function已十分成熟，但许多情况下，我们采用RNAi并不能有效降低目的基因的表达或者表达降低了却检测不到细胞生物学功能的变化，这时候就要用到KO细胞了，且CRISPR-Cas9基因编辑技术介导的基因敲除也可作用于非编码区域基因片段。

表1. 基因敲低与敲除技术比较

另外，我们还可以在建立的KO细胞上进一步进行目的基因的过表达，从而回补正常的基因，以起到恢复表型的作用，从而更充分地证实目的基因的功能。KO细胞为我们研究基因或信号通路的功能提供了帮助，近年来用KO细胞实现loss of function发表的文献也越来越多。

药物靶点的筛选与验证

据统计，目前进入临床研究阶段的药物最终成功上市的比例不到10%，特别是肿瘤相关药物比例更低，不到5%。其中重要的原因在于缺乏有效的药物靶点，一个好的药物靶点可有效降低药物的资金投入和研发周期，并大大降低开发失败风险。自2013年张锋团队在Science首次报道了CRISPR文库显示出比shRNA文库更有效的筛选结果，CRISPR敲除文库已广泛应用于细胞存活信号、耐药性等领域的研究。目前，利用全基因组gRNA文库可以筛选高特异性基因靶点的筛选，对于给药处理后消失或被富集的gRNA，寻找药物敏感性或耐药性相关基因靶点。

但药物靶点的筛选和发现只是第一步，在进行体内实验前还需要经过一系列的有效性和安全性实验，因此，我们可以建立作用靶点KO的细胞系，再通过给药处理，观察细胞表型是否发生变化，从而再根据靶点筛选或开发作用于此靶点的药物。

图1. gRNA文库的建立及药物靶点的筛选和验证

抗体特异性验证

抗体是我们做实验中最常用的试剂之一，应用广泛，通过抗原-抗体反应可揭示多种生命活动变化。但目前商业化抗体的特异性、敏感性和功能性并不一定得到完全验证，不同商家提供的抗体质量也参差不齐，从而导致结果的不一致性，这也使得科学家一直存在“重现危机”。利用KO细胞可有效验证抗体的特异性，针对特异性抗体的KO细胞在验证结果中不会产生信号，而野生型细胞系则可能会产生特异性蛋白信号，因此，KO细胞可作为抗体验证的良好标准品，以确定抗体的特异性。

基因治疗研究

基因治疗是近年来非常热门、发展也非常迅速的一个方向，目前全球已有几百个基因编辑介导的基因治疗临床试验在进行，常用的基因治疗方式包括基因修饰、基因失活、基因置换等。例如利用敲除自体T细胞的PD-1基因的方法来治疗包括前列腺癌、食管癌和肾细胞癌在内的癌症；敲除BCL11A的红系特异性增强子从而上调自体红系HSC中的γ球蛋白，可作为镰刀状细胞病和β-地中海贫血的潜在治疗方法等，这些研究或临床试验都是利用CRISPR/Cas9基因敲除技术实现的。

总之，KO细胞系无论在基础研究还是药物研发等领域都具有良好的应用前景，由于其可实现基因功能彻底缺失、可调控基因组任意片段、方便进行回复实验等优点，是疾病机制和药物靶点研究中不可替代的一环。