平面状的细胞片立体地！ 细胞用自己的力量将薄片三维化 ―期待应用于适合内脏器官表面的移植治疗用细胞薄片

平面状的细胞片立体地！ 细胞用自己的力量将薄片三维化

―期待应用于适合内脏器官表面的移植治疗用细胞薄片

发表的要点
利用离子束加工技术，开发了利用细胞拉伸粘合面的极小的力就可以很容易变形的“柔性细胞培养薄膜”

使细胞粘接在薄膜表层，通过细胞的移动将表层从拉伸基板上剥离，成功制作出了具有褶皱和突起一样的三维( 3D )结构的“3D细胞片”

期待应用于适合胃和肠等有凹凸的内脏器官表面的移植治疗用细胞薄片。

国立研究开发法人量子科学技术研究开发机构(理事长平野俊夫)量子束科学部门高崎量子应用研究所的大山智子主干研究员、大山广太郎主干研究员、田口光正项目负责人和东京都立大学(校长大桥隆哉)的三好洋美副教授使用离子束加工技术， 开发了即使细胞拉伸粘接面的极小的力(牵引力)也能变形的“柔性细胞培养薄膜”，提高细胞能充分发挥力的粘接性，再通过调整薄膜的厚度和图案，成功制作出了具有褶皱和突起状结构的“3D细胞片”。

在我们身体中看到的褶皱、突起等立体结构( 3D结构)，是内脏器官发挥各自功能的最佳选择。 我想通过培养从身体中取出的细胞来研究细胞是如何形成这样的3D结构的，但是即使在一直以来使用的硬塑料盘上培养，细胞也只能呈平面状扩散，不能形成3D结构。

细胞虽然是非常小的力量，但我们知道在活动时会拉伸粘接面。 我们关注着这个牵引力，想让细胞做和捏柔软的布会起皱纹一样的事。 因此，我们的目标是开发出细胞活动时能够以极小的力变形的柔性细胞培养用薄膜，并在此基础上培养，使细胞抓住薄膜，形成褶皱和突起。

利用离子束1 )的加工技术实现了这个想法。 通过精密控制离子束引起的化学反应的种类和场所，可以得到兼具生物相容性2 )和生物降解性3 )的聚合物乳酸4 )在细胞培养中，只要施加极小的力，就会形成表面作为薄膜剥离的装置。 这个装置是由提高了细胞牢固发挥牵引力的表层，以及在培养中溶解于培养液的下层、表层和下层基础的基板组成的。 我们发现，如果将这个表层调整到能够用细胞极小的力变形的厚度，每个细胞都会拉伸表层，在周围褶皱的同时移动。 并且，为了在细胞的活动中薄膜容易剥离，在表层进行了图案化(制作剪切线)，结果发现细胞集团从图案的端部，也就是剪切线开始剥离薄膜，发生立体变形。 利用这一现象，调整图案的形状和大小后，仅用2-3天就成功制作出了具有肉眼也能看到的巨大褶皱和突起的3D细胞片。

一个细胞所能产生的力量虽然很小，但是在柔软的身体中，细胞有可能相互协作来整理周围的环境，从而自身形成立体的结构。 可以利用细胞极小的力量制作3D细胞片的柔性细胞培养薄膜，被认为是解开细胞本来面目和功能的重要工具。 并且，期待着新的治疗技术的开发，不仅能揭开谜团，还能应用于与胃和肠等凹凸不平的内脏器官表面相适应的移植治疗用细胞层等。本成果将于令和3年7月14日(周三) (日本时间)在报告新构想的材料工学和实用APP的学术“Materials & Design”上刊登。另外，本研究的一部分得到了国立研究开发法人科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业ACT-X (研究者:大山智子，JPMJAX2014 )的支援。

【本案相关咨询方式】

（研究内容）国立研究开发法人量子科学技术研究开发机构量子束科学部门高崎量子应用研究所尖端功能材料研究部主干研究员大山智子 TEL：[phone] E-mail：ohyama.tomoko[at]qst.go.jp 东京都立大学系统设计系机械系统工科副教授三好洋美TEL：042-677-2713 E-mail：hiromi-miyoshi[at]tmu.ac.jp （JST 事業） 国立研究开发法人科学技术振兴机构战略研究推进部前田知子 TEL：[phone] E-mail：act-x[at]jst.go.jp （報道担当） 国立研究开发法人量子科学技术研究开发机构经营计划部宣传科 TEL：[phone] E-mail：info[at]qst.go.jp 东京都公立大学法人东京都立大学管理部企划·宣传科宣传系 TEL：[phone] Email：info[at]jmj.tmu.ac.jp 国立研究开发法人科学技术振兴机构宣传科 TEL：[phone] E-mail：jstkoho[at]jst.go.jp

补充说明资料

【研究背景】在我们的脑·食道·胃肠等许多内脏器官表面，可以看到许多褶皱和突起等立体结构( 3D结构)。 正如大家知道的那样，大脑通过褶皱增加表面积，从而可以进行大量的信息处理，肠子通过突起和褶皱有效地吸收营养，这些3D结构为内脏器官正常发挥了最佳的形状。 如果胎儿期不能顺利形成褶皱和突起，就会发生像滑脑症5 )那样的先天性异常，没有有效的治疗方法。 另外，由于炎症导致褶皱和突起消失的溃疡性结肠炎6 )等，是需要长期治疗的疑难病症。如果能够使内脏器官表面的上皮细胞产生褶皱和突起，则有望恢复失去的结构，恢复内脏器官的功能，但复杂精密的3D结构是如何形成的，其详细情况还不清楚。 因为即使将从身体中取出的细胞在一直以来使用的坚硬的塑料器皿上培养，细胞也只会呈平面状扩散，不会形成褶皱或突起。我们知道，直径只有0.02mm左右的细胞，虽然是极小的力，但在活动时会拉伸粘接面。 我们关注着这种牵引力，想让细胞做和抓住柔软的布会起皱纹一样的事。 因此，我们开发了细胞活动时用极小的力就能变形的柔性细胞培养用薄膜，在此基础上培养，从而使细胞抓住薄膜完成了形成褶皱和突起的目标(图1 )。

【研究成果】为了实现这个想法，需要具有高度柔软性的特殊材料，即使是细胞极小的牵引力也能够变形。 另一方面，在开始培养之前，如果弯曲或破裂，就无法使用。 因此，本研究考虑了细胞培养开始后，也就是在37℃的液体中施加极小的力时表面将作为薄膜剥离的结构。活用的是作为量子束的一种的离子束1 )。材料选择了兼具生物相容性2 )和生物降解性3) 的聚乳酸4 )。   离子束具有切断材料中的分子，或称为“交联”将分子之间连接起来的作用。聚乳酸在通常的照射下被切断的概率压倒性地高，但如果过度照射，反而会进行交联，逐渐碳化。 也就是说，根据照射所赋予的能量密度的不同，聚乳酸中发生的化学反应也不同。  本研究根据这一见解，调整离子束带来的能量疏密，精密控制分解和交联碳化发生的地方，在聚乳酸表面极浅的区域，通过一次照射成功制作出了由交联碳化的表层和分解的下层组成的双层结构(图2 )。被交联的表层由于能够形成羟基(-OH )和C=C等新的化学键，细胞的粘接性大幅提高。 这样，粘在这个表层的细胞就可以充分发挥牵引力。 另一方面，分解后的下层会降低玻璃化温度7 )和熔点8 )，因此在温水中很容易软化，不久就会溶解。 这种双层结构在室温大气中保管期间虽然很稳定，但是如果在培养环境( 37℃的液体中)中摩擦等施加力，表层会沿着照射图案的端部，也就是设定的剪切线作为薄膜剥离(图2 )。

图2 .培养中施加力时表层会剥离的特殊装置

并且，在本研究中，通过调整离子束的到达距离来控制2层结构的厚度，探索了细胞发出的极小的力也能够变形的表层厚度。 结果显示，使用距离聚乳酸表面180 nm左右侵入的50 keV的氮离子制作上述2层结构时，出现了上皮细胞逐个拉伸表层，向周围皱折移动的情况。 (图3 )。这就和捏放在桌子上的手帕时的现象一样。 于是，为了用双手拉伸手帕之后会出现褶皱，反映细胞的牵引力和动作而形成的薄膜褶皱就像在各个细胞之间架桥一样相连。 褶皱形成于0.6毫米( 30个细胞)和遥远的细胞之间(图3 )，有趣的是，细胞仿佛通过褶皱互相告诉了彼此的位置，沿着褶皱以最短的距离在彼此的地方来回移动。 被认为是因为细胞有沿着粘接面的凹凸前进的倾向，也许，在柔软的身体中也在进行着这样有效的细胞移动。

图3 .细胞产生褶皱的同时剥离表层，通过褶皱相互影响的情况(箭头表示细胞的位置)

并且，在本研究中，为了在细胞的活动中薄膜容易剥离，在表层进行了图案化(制作剪切线)。 于是，细胞集团开始从图案的边缘，也就是剪切线剥离表层，开始立体变形。 图4显示的是用48小时将细胞构图为细长的薄膜拼凑在一起的情况。

图4 .细胞从剪切线剥离表层，立体变形的样子。白箭头所示的粒子一个一个都是细胞。细胞开始从切割线剥离表层，朝黑箭头的方向聚集薄膜。

细胞集体剥离变形薄膜，仅用2-3天的时间，根据设定的图案形成了肉眼也能看到的巨大3D结构。 图5显示的是接近1厘米的巨大结构体。 非常不能接受显微镜照片，分成几张照片将照片连接在一起。观察其断面，就会发现细胞把薄膜揉成团，形成褶皱。 从细的图案可以形成褶皱，从圆的图案可以形成突起。在以前用于培养的硬塑料盘上，细胞没有形成3D结构。 本成果表明，细胞牢固粘合、可发挥牵引力的环境，以及细胞小力量可灵活变形的环境，在褶皱、突起等3D结构的形成中起着重要的作用。 在柔软的身体中，细胞有可能相互合作，调整周围的环境，自己形成立体的结构。

图5仅用3天就形成了肉眼也能看到的巨大褶皱。

( a )全长约7mm的整体像照片、用荧光显微镜观察( b )( a )的一部分的图像、( c ) ( b )的虚线部的截面图像。

【今后的展开】

可以利用细胞极小的力量制作3D细胞片的柔性细胞培养薄膜，被认为是解开谜团较多的细胞本来的样子和功能、生物体复杂形成之谜的一个工具。 而且，3D细胞片不仅对生命科学，对医疗领域的贡献也备受期待。 现在，除了开发用于更精密且再现性好地制作3D细胞片的技术之外，还在同时进行对实际存在于生物体内的物质进行精密加工，再现生物体内环境的研究。 如果能够用更接近生物体的物质制作出更像内脏器官褶皱或突起的3D细胞层，那么，就可以作为能够正确评价疾病机制和药效的生物体模型来利用了吧。 此外，还有望对移植治疗做出贡献，代替患者身体中的缺损部位，治疗疾病部位。 虽然平面状的细胞层已经在进行临床研究，但是期待着通过与凹凸较大的内脏器官也相适应的3D细胞层，能够治疗的内脏器官和治疗范围会大幅扩大。

【用语解说】

1 )离子束是指被加速器高速加速的离子

2 )生物相容性不危害身体，熟悉的性质

3 )生物降解性在身体中分解的性质

4 )聚乳酸由从植物中提取的淀粉发酵得到的乳酸制作的透明性和刚性高的高分子材料。 治愈后在体内分解吸收的缝合线和植入物等，被用作医用材料。

5 )滑脑症

天生大脑表面平滑，看不到褶皱的病。 指定疑难病症，引起智力障碍、运动障碍、癫痫发作等。

6 )溃疡性结肠炎指定疑难病症，引起大肠粘膜发炎，持续腹痛、腹泻和便血等。 国内患者人数约18万人，逐年增加。

7 )玻璃化转变温度高分子材料中的分子变得容易运动，开始软化的分界线的温度。

8 )熔点固体开始溶解，变成液体时的温度。

【论文信息】3D cell sheets formed via cell-driven buckling-delamination of patterned thin films Tomoko Gowa Oyama1,*, Kotaro Oyama1,*, Hiromi Miyoshi2 , and Mitsumasa Taguchi1

1 :量研量子束科学部门高崎量子应用研究所尖端功能材料研究部

2 :东京都立大学系统设计系机械系统工程系

* * :共同笔头作者