WB, IHC实验问题总结与处理方案详解

Western Blot常见问题及处理

1、western blot 的优点

答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。

2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？

答：原因有很多：

a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；

b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；

c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。

3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长， b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？

答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。

5、我的目的带很弱，怎么加强？

答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。

6、胶片背景很脏，有什么解决方法？

答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。

7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？

答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。

8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；

b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；

c) ECL底物没覆盖到相应位置；

d) 二抗失活。

9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。

10、DAB好还是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。

11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？

答：a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。b)蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等。

12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？

答：可能是：a)样品浓度过低；b)转移时间不够。

13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？

答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。

14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？

答：① 免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。

② 两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

15、做Western Blot时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？

答：怀疑是样品问题，可能是：

1，样品不能反复冻融；

2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

16、细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？

答：一般5×10^6就足够了。

17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？

答：能，没有问题。

18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？

答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？

答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？

答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，加20％甲醇。

21、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？

答：200kd的蛋白不好做， 分离胶用7％，积层胶 3.5％。

22、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？

答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。

23、蛋白变性后可以存放多久？

答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

24、我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？

答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？

答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

26、问一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？

答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。

27、做组织样品的western的时候，怎样处理样品？

答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。

28、问大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。

29、有什么方法可以提高上样量？

答：a)可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量；b)用5倍的上样缓冲液来稀释变性

30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

答：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超载。

31、一抗，二抗的比例是否重要？

答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

32、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

33、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？

答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

34、Western Blot 中抗体的可以重复应用吗？

答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

35、在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？

答：可以。

37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？

答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。

38、做Western Blot时，同样的抗体免疫组化能做出，而Western Blot却不能？

答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和免疫组化。

39、如果是6×8转印膜，要加多少一抗？

答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。

40、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。

答：无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。

41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？

答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂。

42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？

答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE， 湿转120mA， 45-60min就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。

43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？

答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）。

44、我用的是可视marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。

答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。

45、是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？

答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。

46、核内抗原Western Blot内参选择什么合适？

答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。

47、做半定量Western Blot，内参β-actin，GAPDH哪个好？

答：选用beta-actin就可以。

48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？

答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。

49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？

答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 调节pH 至 7.4, 加水定容至 1L。

50、封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下?

答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。

51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

52、怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？

答：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：

（1）电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55v，分离胶75v就能跑得很好。

（2）胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶.

53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?

答：小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去了。

54．电泳中常出现的一些现象：

●︶ 条带呈笑脸状

原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

●︵ 条带呈皱眉状

原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

●拖尾

原因：样品溶解不好。

●纹理（纵向条纹）

原因：样品中含有不溶性颗粒。

●条带偏斜

原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。

●条带两边扩散

原因：加样量过多。

55．Western blot结果中背景较高

可能的原因及建议：

●膜封闭不够

延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

●一抗稀释度不适宜

对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

●一抗孵育的温度偏高

建议4℃结合过夜。

●选择的膜容易产生高背景

一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。

●膜在实验过程中干过

实验过程中要注意保持膜的湿润。

●检测时曝光时间过长

减少曝光时间。

56．Western blot结果中杂带较多

可能的原因及建议：

●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

●目的蛋白有其它剪切本

查阅文献或生物信息学分析可能性。

●样本处理过程中目的蛋白发生降解

加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

●上样量过高，太敏感

适当减少上样量。

●一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体。

●一抗不纯

纯化抗体

●一抗或者二抗浓度偏高

降低抗体浓度。

57 . Western blot结果中无信号或显示信号弱

可能的原因及建议：

●检测样本不表达目的蛋白

选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

●检测样本低表达目的蛋白

提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

●转移不完全或过转移

可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

●抗体不能识别测试种属的相关蛋白

购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

●一抗孵育时间不足

建议4℃结合过夜。

●二抗与一抗不匹配

选择针对一抗来源的种属的抗体。

●洗膜过度

洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

58. 其它现象：

●膜上多处出现黑点或黑斑

原因：抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。

●反白（条带显白色）

原因：目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。

●蛋白分子量偏低或偏高

原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

59．安全问题：

操作有毒试剂时，带手套和口罩，且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。

IHC问题总结

Q1：边缘效应?

1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

Q2：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？

1） 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。

2） 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

3） 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

4） 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

5）  DAB孵育时间过长或浓度过高；

6） PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；

7）  标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

Q3：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？

1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。

2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合;建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。

3）组织切片本身这种抗原含量低；

4）血清封闭时间过长。

5）DAB孵育时间过短。

6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。

7）开始做免疫组化，一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

Q4：背景强的原因?

1）考虑一抗浓度高；

2）然后调整DAB孵育时间；

3）也要考虑血清封闭时间是否过短

4）适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。

Q5：石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？

1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度

2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做

3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织，

4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

Q6：一抗从4度拿出后，为什么要进行37度复温？

1） 一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；

2） 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

Q7：切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？

全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：

1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。

2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。

DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。

4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。

6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

Q8：脱片产生的原因有哪些？

1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。

2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。

3）没烤好，时间短，温度不够之类。

4）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

5）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。

6）一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。

7）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。

Q9：DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？

1）切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。

2）有可能是你 显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。

3）如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5 cm。

Q10：染色过强

1）抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）；

2）孵育温度过高；

3）DAB显色时间过长或DAB浓度过高，显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准。

Q11：非特异性背景染色

1）操作过程中冲洗不充分；

2）组织中含过氧化物酶未阻断 ，可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长；

3）组织中含内源性生物素，可用正常非免疫动物血清再封闭；

4）血清蛋白封闭不充分，可延长血清蛋白封闭时间。

Q12：染色弱

1）抗体浓度过低，孵育时间过短，可提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟；

2）试剂超过有效使用期 及时更换试剂；

3）操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释，可每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）；

4）室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）；

5）蛋白封闭过度，封闭时间不要超过10分钟。

Q13：染色阴性

1）操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照；

2）组织中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果；

3）一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误。

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