科研 | IJMS：OsNAC006转录因子影响水稻耐热性和耐旱性（国人作品）
编译：Yong-qin，编辑：十九、江舜尧。
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水稻（Oryza sativa）是人类重要的粮食作物之一，非生物胁迫会影响植物生长发育和表型，其中盐胁迫对作物生长起不利影响。干旱条件（极端环境）对水稻生长造成不可逆损害，降低作物产量和品质；高温胁迫则影响水稻开花，降低作物产量。而植物内进化出各种调节因子产生非生物胁迫的抗性，包括转录因子（TFs）。
水稻中，共有2408个转录因子基因，分为56个基因家族。其中AP2/ERF（乙烯响应因子）、bZIP（碱性亮氨酸拉链）、NAC、MYB、WRKY家族转录因子在非生物胁迫中发挥作用。拟南芥中过表达AtNAC07、AtNAC019、AtNAC055可增强耐旱性，AtNAC2则与乙烯信号通路有关，影响植株侧根发育。水稻中OsNAC67的表达与耐盐性和耐旱性有关，而玉米中ZmSNAC1基因与耐旱性有关。
CRISRP/Cas9基因编辑技术被应用于水稻上的多种重要基因，对育种和了解基因功能具有重要意义。传统转基因技术由T-DNA插入载体介导，而CRISRP/Cas9的优点在于其准确性和简便性，并且产生非转基因株系，但突变植株经过几代性状分离后会丢失CRISRP/Cas9载体。
本研究克隆了水稻上一个编码NAC转录因子的基因OsNAC006，并表明该基因的突变会影响水稻耐旱性和耐热性。
论文ID
原名：Knockout of the OsNAC006 Transcription Factor Causes Drought and Heat Sensitivity in Rice
译名：OsNAC006转录因子影响水稻耐热性和耐旱性
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.183
发表时间：2020.03
通讯作者：陈成彬
通讯作者单位：南开大学生命科学学院
DOI号：10.3390/ijms21072288
实验设计
① 植物材料。粳稻品种'日本晴’的野生型（WT）和转基因（OsNAC006）株系。干旱胁迫采用不灌溉7d处理，高温胁迫采用42℃培养处理。
② RT-qPCR。定量测定干旱和高温胁迫下OsNAC006的表达模式。
③ 亚细胞定位。构建pZmUbi::OsNAC006-eGFP::HspT载体整合到水稻原生质体，通过GFP确定OsNAC006在细胞内的位置。
④ CRISPR-Cas9诱变及分析。CRISPR-Cas9载体（pZHY988）靶向OsNAC006基因，导入农杆菌后感染水稻愈伤组织。选择4周苗期的幼苗进行生理学测定。5周苗期的干旱胁迫的幼苗进行RNA-seq。
结果
1、OsNAC006的表达谱和亚细胞定位
本试验分析OsNAC006基因在水稻8个组织（幼苗的根/茎/叶、抽穗期的根/茎/鞘/叶/穗）的表达水平，提取RNA进行RT-qPCR。结果表明，OsNAC006在幼苗和抽穗期的各个组织均有表达，茎和叶中的表达量最高（图1A）。通过GFP信号检测OsNAC006在原生质中的定位（eGFP为阴性对照），共焦显微镜图像显示OsNAC006定位于细胞核（NLS为核标记物）（图1B）。
此外，研究者评估了OsNAC006是否受非生物胁迫及外源激素等的影响。结果表明，H2O2、NaCl、PEG-6000的处理下，OsNAC006的转录水平显著上升，而高温和低温胁迫均使OsNAC006的转录水平先升高后下降。外源激素IAA、GA处理使OsNAC006的表达水平在3h和6h后达到峰值，而ABA处理导致其表达水平逐渐上升（图1C）。这表明OsNAC006的表达差异受不同的非生物胁迫的影响不同。
2、OsNAC006突变株的产生
由于NAC家族转录因子在水稻中的作用研究较少，因此本研究尝试探索OsNAC006基因的生物学作用。为研究OsNAC006在外界胁迫下的作用，作者使用CRISPR/Cas9系统敲除OsNAC006基因，根据plantTFDB数据库的基因序列信息，设计sgRNA靶向OsNAC006的第一个外显子（图2A），在选择10株经CRISPR/Cas9处理的第一代植株，进行酶切分析，发现6株成功的等位基因突变，以及1株杂合突变（图2B）。Sanger测序结果显示，突变序列包括插入单碱基对（+1bp/+1bp）、缺失单碱基对（-1bp/-1bp）、缺失大片段碱基对（-55bp/-55bp）（图2C）。在正常生长条件下，三种突变株和野生型表现相似的表型和生长状态（图2D）。
图2 CRISPR/Cas9产生的OsNAC006突变株。（A）sgRNA靶标位点；（B）10株突变株的突变位点多态性；（C）突变位点的序列；（D）突变株的表型。
3、OsNAC006突变株的耐热性和耐旱性
非生物胁迫处理后，OsNAC006突变株的表型表明水稻耐热性和耐旱性被抑制（图3A和D）。进一步分析发现，NBT染色（检测超氧物歧化酶活性）和DAB（检测过氧化物酶活性）染色，在正常条件下野生型和突变体无差异，而干旱或高温胁迫下可看出突变株的O2-和H2O2含量较高（图3B和E）。在干旱和高温胁迫下，突变植株的叶绿素含量明显降低，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性降低，丙二醛（MDA，一种膜脂过氧化的标志物）含量上升（图3C和F）。这些结果表明OsNAC006在水稻中的作用可能是在干旱和高温胁迫下，通过削弱植株内抗氧化反应，并介导光合作用，从而赋予植株耐旱和耐热性。
图3 干旱/高温环境下OsNAC006敲除对水稻表型和生理生化的影响。
4、OsNAC006基因敲除对水稻转录组的影响
本研究为探究在干旱胁迫下受OsNAC006调控的基因，作者选择干旱条件和正常条件下的野生型（WT）、55bp缺失的突变株（osnac006_1）、突变株自交后代（osnac006_2）进行RNA-seq，共6个样品。参考基因组平均比对率为88.67%，鉴定基因共32482个，并检测到新的转录本15871个，其中12778个预测为已知蛋白编码基因的可变剪接新亚型，570个为假定蛋白。RNA-seq结果显示，干旱胁迫对水稻的基因表达带来显著改变（图4A和C）。与野生型相比，在正常条件下，突变株osnac006_1有4832个基因上调，1512个基因下调；osnac006_2有1814个基因上调，2833个基因下调（图4B）。干旱胁迫下，osnac006_1上调基因527个，下调1209个；osnac006_2上调基因1412个，下调基因1091个（图4D）。筛选这两种突变体共有的差异表达基因（DEGs），发现正常条件下有1661个，干旱胁迫下有793个，分别进行GO富集分析。富集分析分析发现，差异表达基因富集于细胞膜、细胞器的功能，功能类别富集于氧化还原酶活性、结合辅助因子、调控因子，生物学功能富集于氧化还原、多细胞生物过程、胁迫响应。其中，胁迫响应、细胞器相关、氧化还原酶活性的编码基因表达差异较显著（图4E）。
5、干旱胁迫下OsNAC006对水稻的转录调控
通过对突变体的差异表达基因的富集分析，确定了12个富集区。KEGG富集分析则表明，受影响的代谢途径包括植物激素信号转导、MAPK信号转导、二萜类生物合成、类胡萝卜素生物合成、光合酶、ABC转运蛋白、淀粉和蔗糖代谢。根据KEGG富集结果，我们选择4个最显著的途径进行细化的差异分析。结果表明，受影响的植物激素关键基因包括油菜素类固醇受体基因（Os01g0718300/Os05g0207500）、乙烯响应因子（Os02g0820900）、生长素应答因子（Os04g0671900/Os06g0702600）、ABA结合因子（Os06g0211200）（图5A）。Os03g0685000是一个光合作用相关酶的基因，参与电子传递链，影响氧化还原过程（图5B）。Os02g0110200是编码过氧化物裂解酶的基因，Os03g0767000是编码过氧化物脱水酶中与血红素铁结合的活性部位的基因（图5C）。干旱胁迫处理也影响了细胞膜细胞膜相关的二萜类代谢和氧化还原酶的活性（图5D）。
讨论
干旱胁迫是危害作物产量的重要因素，全球约20%作物受干旱影响。研究表明NAC转录因子在植物抗逆性方面起重要作用。水稻OsNAC2的表达会抑制其耐盐和耐旱性。本研究则发现OsNAC006基因受多种胁迫诱导表达，如非生物胁迫和激素胁迫。OsNAC006突变体对干旱和高温的耐受性降低，叶绿素含量下降，POD和SOD酶活性降低，这些抗氧化酶活性与植物耐受性相关。RNA-seq发现胁迫响应途径最受影响的是植物激素信号途径和丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号途径，先前研究表明拟南芥丝裂原激活蛋白激酶基因受茉莉酸诱导，影响植物耐旱性和抗病性。
综上，本研究的转录组数据为OsNAC006在水稻耐旱性中发挥作用提供论证。OsNAC006基因定位于细胞核内，受多种非生物胁迫和激素诱导，它调控植物抗逆性、氧化还原酶活性、辅助因子结合、细胞膜相关的基因表达。这一结论为揭示植物抗旱性的分子机制提供参考。
评论
水稻在生长过程中会受到各种非生物胁迫，而植物特有的的NAM、ATAF、NAC家族转录因子发挥重要作用，然而目前水稻中约有170个NAC转录因子功能未知。本研究发现OsNAC006基因受H2O2、温度胁迫、植物激素的诱导，并影响植物的耐旱性和耐热性。转录组分析则发现OsNAC006调控水稻应激反应、氧化还原酶活性、辅助因子结合、细胞膜相关的基因表达。该结论表明了OsNAC006基因对植物抗逆性的重要作用。
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