科研│复旦大学：乳腺癌潜在新生标志物-差异表达circRNA的图谱和综合分析（国人佳作）
编译：微科盟 伊安，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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乳腺癌(BC)是一种全球常见的癌症，在女性中发病率和死亡率最高且呈上升趋势。新生标志物的发现对BC的早期发现、治疗和预后具有重要意义。在本研究中，研究人员通过竞争内源性RNA (ceRNA)微阵列研究差异表达（DE）环状RNA (circRNAs)，构建了全基因组环状RNA表达谱。同时对circRNAs的宿主基因（HGs）进行GO和KEGG分析，结果显示共检测到4,370个DE circRNAs，GO和KEGG分析这些DE circRNAs与细胞周期、DNA复制、乳腺癌和家族性乳腺癌显著相关。通过RT-PCR验证差异circRNAs和相关HGs，并推测构建了一个circRNA-microRNA-mRNA调控网络。8个circRNA，包括hsa_circ_0069094，hsa_circ_0062558，hsa_circ_0074026，hsa_circ_0079876，hsa_circ_0017536，hsa_circ_0023302，hsa_circ_0017650和hsa_circ_0017545，在BC组织中显著差异表达，并与TNM分期、淋巴细胞浸润和Ki67相关；其中，Hsa_circ_0069094、hsa_circ_0079876、hsa_circ_0017650和hsa_circ_0017526在血浆中显著上调。本研究揭示了BC中特异性DE circRNAs的一般表达特点，hsa_circ_0069094、hsa_circ_0079876、hsa_circ_0017650和hsa_circ_0017526可能是有前景的候选靶点。
论文ID
原名：Profiling and integrated analysis of differentially expressed circRNAs as novel biomarkers for breast cancer
译名：乳腺癌新生标志物—差异表达circRNA的图谱和综合分析
期刊：Journal of cellular physiology
IF：5.546
发表时间：2020年1月
通讯作者：姜颖
通讯作者单位：复旦大学
DOI号：10.1002/jcp.29449
实验设计
结果
1 乳腺癌中CircRNAs和HGs总表达谱
ceRNA微阵列探针首次用于检测6对BC和相应癌旁正常组织中的大量转录本。表1列出了纳入芯片分析的6例患者的详细信息。在BC组织和正常组织中DE circRNAs和mRNA的热图、散点图和火山图如图1所示。结果表明，共有4370个circRNAs(图1a-c)和1380个mRNAs(图1d-f)为DE，FC>2.0或<0.5，p<0.05。其中，2375个circRNAs和556个mRNAs在这些BC/邻近组织中上调，而1,995个circRNAs和824mRNAs在这些BC/邻近组织中表达下调。将其HGs的circRNAs和mRNAs的表达谱结合，列出了其不同阈值的主要部分。当FC>5.0或<0.2，p<0.05时，共有403个DE circRNAs。当FC>10.0或<0.1，p<0.05时，共有33个DE circRNAs(表2)。其中上调最多的是hsa_circ_0069094，下调最多的是hsa_circ_0019217，它们分别由HGs S100P和RBP4产生。此外，在这6例乳腺癌患者的乳腺癌组织中，有11种circRNA HGs (S100P、MMP11、PITX1、ANLN、KIF4A、UBE2T、INHBA、FAM83D、ASPM、CDC20和NEK2)上调，7种circRNA HGs (RBP4、AKR1C1、AKR1C3、MYEOV、ITIH5、GPX3和SEMA3G)下调，这些结果与与circRNAs的表达水平一致，FC>10.0，p<0.05。
表1.纳入芯片分析的6例患者的详细信息。
表2.乳腺癌中部分差异表达circRNAs及其差异表达HGs。
图1.乳腺癌(BC)中circRNAs的微阵列表达谱。(a–c) 乳腺癌和癌旁正常组织中circRNA的表达谱(n=6) a：热图；b;散点图；c：火山图；(d和e)显示mRNA表达谱；d:热图；e：散点图；f：火山图。红色图示差异上调的RNA，蓝色图示下调的RNA。FC>2.0，P<0.05为显著DE RNA。
2 差异表达circRNAs富集分析
作为一组新发现的非编码RNA (ncRNAs)，对于揭示circRNAs功能是有限的。幸运的是，此次研究中大多数circRNAs都可以映射到它们的HGs上，并参与转录过程。首先，通过富集与临床疾病相关的基因，研究者发现与乳腺癌、家族性乳腺癌和乳腺肿瘤相关的关键调控基因在研究结果中富集(P分别为5.16E-06和7.06E-04和3.82E-04；图2a)。其中，与BC相关的HGs包括BRCA1、APC、BRCA2、BRIP1、CHEK2、CDH1、PRC1、TGFB1、BARD1和ATM，与家族性BC相关的关键调控基因包括BRCA1、RAD51、APC、ABCC1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、ERBB2、PRC1、NCOR1、TP53、PALB2、BARD1和PIK3R。这表明有相当一部分基因可能通过线状 RNAs和circRNAs的剪接参与了BC肿瘤的发生。
为了进一步研究DE circRNAs如何参与BC肿瘤的发生，通过KEGG富集分析DE circRNAs的HGs的特征和相互作用。有趣的是：与肿瘤相关的一些通路如细胞周期、代谢通路、p53信号通路、DNA复制和药物代谢等都得到了显著富集，图2b显示了前30个富集的KEGG通路。值得注意的是，细胞周期信号通路涉及DE circRNAs中最多的HGs，如图2d所示。细胞周期相关基因MCM、E2F1/2/3、CHEK1/2、CCNB1/B2、PCNA、Pttg1、BUB1B、PRKDC、CDC20、MAD2L1、PLK1、CDK1 ORC6和ESPL1上调，而CCND2和KIP1/2下调。其中CHEK1/2、CCNB和CCND也富含p53信号。此外，通过GO富集分析预测了De circRNAs在BC中的功能，例如:PDGFR -β信号通路、DNA复制起始、DNA链延伸、纺锤体微管与着丝点的附着及其调控、蛋白对着丝点的定位以及端粒的维持；这些HGs的分子功能主要集中在VEGF结合、TGF-β激活受体活性和DNA聚合酶结合；细胞成分涉及大分子复合物、肋节、凝聚复合体、凝聚染色体、着丝粒区等(图2c)。考虑到所有这些重要的GO富集都与细胞增殖、分化和血管生成有关，提示BC中大量的DE CircRNAs可能在多种途径和复杂机制中调节肿瘤的形成和发展起着不可或缺的作用，因此研究人员怀疑circRNAs可能成为未来BC诊断和治疗的新的生物标志物。
图2.乳腺癌差异表达circRNAs HGs的富集分析。(a) DE circRNAs 富集的前30位临床疾病；(b) DE circRNAs HGs富集的前30个KEGG术语；(c) DE circRNAs HGs富集的前30个GO术语；(d) 细胞周期相关的KEGG 通路注释；红色和橙色标记的节点是上调的，而深绿色标记的节点是参与该途径的DE CircRNAs的下调的宿主基因。
3 关键上调的circRNA及其HGs的验证
选择表达上调的前4个DE circRNA及其HGs，分别为hsa_circ_0069094和S100P，hsa_circ_0062558和MMP11,hsa_circ_0074026和PITX1，hsa_circ_0079876和ANLN，通过qRT–PCR对其表达进行验证，首先在BC细胞系(MCF‐7,MDA‐MB‐453,MDA‐MB‐231,MDA‐MB‐468,Hs‐578T细胞)和正常乳腺细胞HBL‐100进行验证（图3）。研究人员发现hsa_circ_0069094 和S100P在所有5个BC细胞系(图3a和3e)中都上调，而hsa_circ_0074026和PITX1在TNBC细胞系(图3b和3f)中上调(mda-MB-231，mda-MB-468和HS-578T；图3b和3f)。Hsa_circ_0062558 和 MMP11上调不一致(图3c和3g)，而hsa_circ_0079876和 ANLN没有上调，(图3d和3h)。总体而言，DE circRNAs和HGs的表达水平是一致的。
有趣的是，所有这四个DE circRNAs及其HGs在121对BC和邻近的正常组织中都被成功地定量(图4)。具体来说，hsa_circ_0069094, hsa_circ_0062558, hsa_circ_0074026和 hsa_circ_0079876在癌组织与癌旁正常组织间差异有统计学意义(分别为72.12±15.51，294.9±82.01，18.88±5.107，24.4±4.001，P<0.05)。HGs均值分别为1100±202.6、556.7±164、153.3±46.61和424.2±87.97，差异有统计学意义(P<0.05)。
图3.qRT-PCR分析BC细胞株中上调的CircRNAs及其HGs的表达水平。hsa_circ_0069094 (a)和S100P (e)在所有BC细胞系中均上调；hsa_circ_0062558 (b)和MPP11 (f)在BC细胞中上调不一致；hsa_circ_0074026 (c)和PITX1 (g)在TNBC细胞系中表达上调；hsa_circ_0079876 (d)和ANLN (h)的表达水平。
图4.与癌旁正常组织比较，BC中上调的circRNA及其HGs表达水平的验证。hsa_circ_0069094(a)和S100P (e),hsa_circ_0062558(b)和 MPP11 (f), hsa_circ_0074026 (c)和PITX1 (g),hsa_circ_0079876 (d)和ANLN (h) 在大多数BC组织中与相邻的非肿瘤组织相比显著上调(n = 121)。
4 下调circRNA的验证
研究人员进一步验证了BC细胞系和组织样本中下调的circRNA。在正常的qRT-PCR过程中，这些circRNA很难在细胞系中检测到，可能是由于它们的低表达所致。因此，将合成时间延长到2小时，并在表1中确定了四个主要的circRNA，包括hsa_cic_0017536,hsa_cic_0023302,hsa_cic_0017650和hsa_cic_0017545 (图5a-d)。接下来研究人员在余下的47对组织样本中验证了这四个circRNA。结果表明，与癌旁正常组织相比，hsa_circ_0017536， hsa_circ_0023302，hsa_circ_0017650，hsa_circ_0017545在BC组织中均显著降低(图5e-h)，这与微阵列数据一致。表3列出了这些经过验证的DE circRNA的详细结果，包括平均值、95%置信区间(CI)、p值和FC>2.0或<0.5的样本百分比的差异。
图5. BC细胞系和组织样本中下调circRNA的验证。(a-d)在BC细胞系中检测到4个circRNA，包括hsa_cic_0017536、hsa_cic_0023302、hsa_cic_0017650和hsa_cic_0017545。(e-h)证实这4个circRNA在BC组织中表达下调(n=47)。*p<.05，**p<.01，*p<.001，*p<.0001。
表3.癌组织和癌旁正常组织中差异表达CircRNA的RT-qPCR验证结果。
5 差异circRNA的circRNA-miRNA-mRNA相互作用分析
通过CircInteractome和MREs分析，研究人员预测了四种上调和下调circRNA的潜在靶标miRNA。然后，研究人员在BC分析中使用TargetScan7.2、miRDB或Starbase3.0与DE mRNAs相结合，以确定这些miRNAs在人类中的假定目标mRNA，并通过cytoscape3.6.1绘制网络图(图6)。根据环状RNA序列中可能结合位点的位置，hsa_circ_0069094预测的miRNA为miR-495-3p、miR-661、miR-542-3p,miR-4504,miR-6837-5p和miR-5092。Hsa_circ_0062558预测的miRNAs为miR-1207-5p/4763-3p,miR-4736,miR-661,miR-7150和miR-1204，而hsa_circ_0074026为miR-1292-3p、miR-4747-3p、miR-2861、miR-3178、miR-6784-5p,miR-661,miR-1294和。据预测，miR-3074-5p、miR-8058/5009-5p,miR-22-5p,miR-145-5p,miR-515-5p,miR-431-5p和miR-767-3p将成为hsa_circ_0079876的靶标(图6a)。类似地，关于有效的下调的circRNA的相互作用如图6b所示。hsa_circ_0017536预测靶向miR-6786-5p、miR-4530、miR-3191-5p、miR-4713-3p、miR-6764-3p和miR-338-3p。Hsa_circ_0023302预测的miR-765、miR-6804-3p、miR-8085/6731-5p、miR-6878-5p、miR-1182和miR-661为miR-6873-3p、miR-3928-5p/6806-3p、miR-3158-5p、miR-6833-3p，而hsa_cic_0017650预测的miRNA为miR-765、miR-6804-3p、miR-8085/6731-5p、miR-6878-5p、miR-1182和miR-661。预测hSA_CIRC_0017545靶点为miR-452-3p、miR-181D-3p、miR-6852-3p、miR-548s、miR-4435和miR-1184。有趣的是，在这些网络图谱中显示了几个潜在的ceRNA轴，它们是hsa_circ_0074026/miR-6784-5p和miR-3178/pix1，hsa_circ_0062558/miR-1204/mmp11和hsa_circ_0023302/miR-1182/myEOV。更重要的是，研究人员发现hsa_circ_0017545和hsa_circ_0074026可能通过包括hsa_circ_0017545/miR-4435/E2F2和hsa_circ_0074026/miR-2861miR-1294/E2F2轴调控E2F2而在细胞周期中发挥作用。有趣的是，在这两个图谱中相互作用的所有重叠中，miR-661、TEAD1和QKI似乎是这两组DE CircRNA之间具有显著联系的交叉点。
图6.circRNA - microRNA (miRNA)‐mRNA对已验证的circRNA的调控分析。(a) circRNA-miRNA-mRNA对hsa_circ_0069094、hsa_circ_0062558、hsa_circ_0074026、hsa_circ_0079876的调控分析。(b) hsa_circ_0017536、hsa_circ_0023302、hsa_circ_0017650、hsa_circ_0017545的circRNA-miRNA-mRNA调控分析。圆形节点和六边形节点代表circRNA及其HGs，菱形黄色节点代表circRNA靶标的假定miRNAs，矩形节点代表miRNAs靶标的潜在mRNA。
6 circRNAs表达与临床病理特征的关系
表4列出了前四位DE circRNA表达与BC患者临床特征的关系(队列2)。其中，hsa_circ_0069094表达水平与肿瘤体积、TNM分期、HER2表达显著相关(p分别为0.024、0.021和0.0002)。此外，hsa_ circ_0069094可能与LN浸润有关(p =0.051)。hsa_circ_0074026表达水平与LN浸润和Ki67水平相关(p分别为0.005和0.022)。此外，hsa_circ_0062558、hsa_circ_0074026、hsa_circ_0079876的表达也与TNM分期呈弱相关(p= 0.054)。同时，我们分析了四种下调circRNA的相关数据，发现hsa_circ_0023302与Ki67相关(p =0.045)。
表4.RT-qPCR验证了上调circRNA与BC的临床病理特征之间的联系。
7 DE circRNAs作为乳腺癌生物标志物的潜力
为了探究经验证的DE circRNA作为临床生物标志物的潜力，研究人员进一步检测了血浆样本中的8种DE circRNA，并绘制受试者工作特征(ROC)曲线。结果表明BC患者血浆中hsa_circ_0069094, hsa_circ_0079876, hsa_
circ_0017650, 和 hsa_circ_0017536的表达明显高于健康对照组(分别为3.14±0.83、1.27±0.39、1.88±0.39和1.2±0.43)，其曲线下面积分别为0.6808、0.6228、0.7586和0.6152(P<0.05；图7)。结合hsa_circ_0069094和hsa_circ_0017650的ROC曲线为0.8469，结合四个circrna的ROC曲线均为0.8397。然后，研究人员使用Kaplan-Meier绘图网络工具对这些在血浆中表达显著差异的DE circRNA的HGs进行生存分析。在癌症基因组图谱队列研究中，S100P和ANLN高表达的BC患者的无复发生存率(RFS)和总生存率(OS)较差(RFS：危险比[HR]=1.5[1.35~1.68]和1.81[1.55~2.12]；OS分别为1.63[1.32~2.03]、1.48[1.08~2.03]；图8a、8b、8e和8f)。然而，ITIH5表达较高的患者有更好的RFS和OS (HR分别为0.66[0.56-0.77]、0.69 [0.5-0.94];图8c和8f)，而AKR1C1较高的患者仅有较好的RFS率(HR = 0.9 [0.8-1];图8d和8h)。
图7.相关DE circRNA作为BC患者生物标志物的可能性。血浆中hsa_circ_0069094 (a,b), hsa_circ_0079876 (c,d), hsa_circ_0017650 (e,f), 和hsa_circ_0017536 (g,h)相对表达水平和受试者ROC曲线。*p <0.05， **p <0.01， ***p <0.001， ****p < 0.0001。
图8. BC患者主要DE circRNAs HGs的生存分析。(a-d) 通过TCGA的S100P、ANLN、ITIH5和AKR1C1对BC患者进行无复发生存分析。(e-h) 过TCGA的S100P、ANLN、ITIH5和AKR1C1对BC患者进行总体生存分析。
讨论
BC是世界上第二常见的癌症，是女性发病率和死亡率最高的癌症。新的生物标记物的发现是有必要的，以优化未来的药物治疗这种恶性肿瘤。据研究人员所知，旨在研究BC的circRNA表达谱及其相关性研究很少。研究人员比较了微阵列和RNA-seq对circRNA的检测效率，发现微阵列比RNA-seq对circRNA图谱的检测效率更高，这在一定程度上支持了微阵列数据的结果。本研究首先选择了6对结直肠癌及其邻近的正常组织样本进行微阵列分析，这是有史以来样本量最大的一次。更重要的是，在研究中验证的circRNA以前从未被报道过。因此，本次研究对于深入了解人类BC中DE circRNAs及其HGs的一般特征具有不可缺少的重要意义。
总的来说，研究人员发现了4370个DE circRNAs和1380个FC>2.0的DE mRNA (p< .05)。其中，2375个circRNAs和556个mRNA表达上调，1995个circRNAs和824个mRNA表达下调。这些circRNAs之前鲜有报道，这可能是由于样本大小或组织异质性。hsa_circ_0087378最近被报道在ER阳性的BC中下调，这与我们的数据一致，该circRNA及其HG NTRK2被下调(p分别为001和0.024)。由于研究者使用了大量的微阵列探针、大量的样本量以及更严格的选择阈值，研究人员仍然得到了比以往研究更多的DE circRNAs，这使得研究人员能够探索BC癌变过程中的关键circRNAs。
最初，circRNAs被认为是RNA剪接的转录垃圾，几乎没有生物学功能。然而，越来越多的研究证实，circRNA在生物学过程中以及在多发性恶性肿瘤的临床中发挥着关键作用。由于大多数circRNA是从它们的HGs转录而来的，所以研究人员对DE circRNAs的HGs进行了富集分析。分析表明，DE circRNAs的HGs富集于BC、家族性BC、BC肿瘤、多种生物学过程和细胞周期等与细胞分裂密切相关的途径，提示DE circRNAs在BC细胞增殖、耐药和作为BC的有利治疗靶点方面具有重要作用。
研究人员主要验证了前四个circRNA(hsa_circ_0069094、hsa_cic_0062558、hsa_circ_0074026和hsa_circ_0079876)及其hgs(S100p、mmp11、pitx1和ann)和四个下调的circRNA(hsa_circ_0017536、hsa_cic_0023302、hsa_cic_0017650、hsa_cic_0017545)。尽管细胞系和组织样本之间存在着不一致，但组织表达和微阵列数据的一致性进一步证明了数据的可靠性，这可能归因于细胞系中cDNA合成时间的延长。其中一些DE circRNA是显著相关的临床参数。
更重要的是，研究人员进一步检测了血浆样本中的DE circRNA，发现乳腺癌患者血浆中的hsa_circ_0069094和hsa_ circ_0079876明显高于健康受试者。令人困惑的是，hsa_circ_0017650和hsa_circ_0017536在BC患者血浆中显著高表达，而在组织中表达下调，在生存分析中HGs表达高的患者预后更好。结合hsa_circ_0069094和hsa_circ_0017650后，AUC进一步升高。这一现象背后的机制需要进一步的探索，而这些circRNA作为新型生物标志物的有效性需要更多的样品量进行验证。
虽然HGs在一定程度上得到了验证，但预测网络中的circRNA和miRNAs中，没有一个被讨论或相互连接。正如之前报道的，S100P可以诱导BC的转移，并被证实与BC患者生存期差有关。此外，MMP11是一种新的BC预后因子，ANLN是一种独立于Ki67的预后因子，对原发BC的细胞周期进展是必不可少的。然而，对PITX1的研究显示出不同的结果。最近的研究表明，PITX1与SOX2和TRP63合作维持肿瘤细增殖胞，而早期的研究发现，PITX1是RAS活性和致瘤性的抑制因子。circRNA可以作为miRNA海绵发挥不同的致癌作用，但已报道的circRNA作为一种特定miRNA的海绵，只调节一个靶基因，很少有研究证明circRNA对其HGs的调节作用，如hsa_circ_00001098通过miR-3942调节BARD1。然而，通过交互作用分析，发现hsa_circ_0062558、hsa_circ_0074026和hsa_circ_0023302可能通过一个或多个miRNA来调节它们的hgs。此外，hsa_cic_0069094、hsa_cic_0062558和hsa_cic_0074026之间通过一些潜在的miRNA和靶基因直接或间接地相互作用。此外，还发现，在复杂的预测相互作用网络中，miR-661、转录增强因子TEF-1和QKI似乎是上调和下调的DE circRNAs之间存在显著联系的交叉点。由于QKI被报道是circRNA生物发生的调节者，研究人员怀疑TEAD1也可能起到显著的作用。最重要的是，研究人员怀疑在这种ncRNA的背后可能有一个相当复杂的调控网络，需要做更多的调查才能弄清楚。
本次研究还存在一些局限性。鉴定出的DEcircRNA的功能尚未深入研究。这些预测的circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络需要更多的研究来证实和进一步研究，以了解其背后的功能和机制。目前，研究人员正在通过体外和体内实验，研究已鉴定的DE circRNA参与BC的功能和机制。
结论
在本研究中，研究者构建了BC中特异性DE circRNAs的一般图谱。已经验证和分析了四个在BC中表达最高的circRNAs-hsa_circ_0069094, hsa_circ_0062558,hsa_circ_0074026, and hsa_circ_0079876, 和 4个下调的 circRNAs—hsa_circ_0017536, hsa_circ_0023302, hsa_circ_0017650,和hsa_circ_0017545。其中hsa_circ_0069094、hsa_circ_0079876、hsa_circ_0017650和hsa_circ_0017536在BC患者血浆中的表达水平与正常人有显著差异。因此，这些差异circRNA有望成为筛查和诊断BC的潜在生物标志物或治疗靶点。值得注意的是，这些circRNA作为生物标志物的有效性以及这些circRNA和miRNAs之间相互作用背后的更深层次的机制需要进一步的阐明，以决定它们是否可以应用于BC的临床实践。
1 综述 | Molecular Cancer：非编码RNA的网络及其在乳腺癌中的分子靶点2 科研 | Bone Res：甲基供体S腺苷甲硫氨酸联合25羟基维生素D阻断乳腺癌生长和转移的化学防御作用
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