科研│ISCIENCE：SARS-CoV-2受体和进入基因在人嗅觉神经上皮和脑组织中的表达
编译：白羽，编辑：景行、江舜尧。
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已有报道表明新冠肺炎与嗅觉丧失以及嗅球中存在SARS-CoV-2病毒有关。为了检验嗅觉神经上皮是否为病毒的靶点，研究人员由人嗅觉神经上皮中构建了RNA-seq文库，发现病毒受体血管紧张素转换酶-2(ACE 2)和病毒内化增强子（TMPRSS 2）的编码基因显著表达。研究人员通过分析人类嗅觉单细胞RNA-seq数据集，确定了维持嗅觉感觉神经元完整性的支持细胞表达ACE2和TMPRSS2。ACE2蛋白在人和小鼠嗅觉组织中支持细胞的一个子集中有较高的表达。最后，在小鼠和人类特定脑细胞类型中发现了ACE2转录本。因此，该研究认为在与大脑直接相关的神经元感觉系统中，支持细胞是SARS-CoV-2的潜在入口。
论文ID
原名：SARS-CoV-2 Receptors and Entry Genes Are Expressed in the Human Olfactory Neuroepithelium and Brain
译名：SARS-CoV-2受体和进入基因在人嗅觉神经上皮和脑组织中的表达
期刊：iScience
IF：4.447
发表时间：2020年12月
通讯作者：Alan Carleton 和 Ivan Rodriguez
通讯作者单位：日内瓦大学医学院基础神经科学系和日内瓦大学遗传与进化系
DOI号：10.1016/j.isci.2020.101839
实验设计
由嗅觉神经上皮中构建RNA-seq文库→差异表达分析（发现显著表达基因）→监测出存在同时转录显著表达基因的细胞→免疫染色检测小鼠和人该蛋白在嗅觉神经上皮中的表达→评估其在小鼠和人类中枢神经系统神经元和非神经元细胞类型中的潜在共表达。
结果
1 ACE2和TMPRSS2人支持和呼吸纤毛细胞的表达
哺乳动物鼻腔可分为呼吸区和嗅觉区，它们在解剖上、细胞上和功能上都不同(图1a)。研究者收集了4例成人鼻内镜手术活检标本，并探讨了其ACE2和TMPRSS2潜在的表达情况。通过采集鼻呼吸和嗅觉感觉上皮标本提取大量组织RNA，生成文库并测序(图1b)。
为了评估解剖的特异性，对呼吸道和嗅觉上皮数据集进行了差异表达分析(图1b)。发现嗅觉特异性基因包括：嗅觉受体基因、CNGA 2和ANO 2、OMP、和ERMN(编码嗅觉转导级联的关键元件，分别是成熟嗅觉感觉神经元的特异性标记和支持细胞的标记)在嗅觉样本中显著富集。(图1C-1E)。随后评估ACE2和TMPRSS2转录本的存在。 研究者观察到呼吸上皮样本中ACE2和TMPRSS2均值分别为7.1和63.7 TPMs(图1F和1G)，反映出代表SARS-CoV-2靶点的纤毛细胞的存在。在感觉神经上皮样本中发现ACE2和TMPRSS2均值分别为4.6和76.1个TPMs(图1F和1G)，表示在这一组织中可能存在同时表达ACE2和TMPRSS2两种基因的细胞，或表达这两种基因其中之一的细胞的混合。
图1.嗅觉和呼吸的鼻上皮中ACE 2和TMPRSS 2的表达。(A)人鼻呼吸上皮和嗅觉上皮的各自细胞类型示意图。(B)大量组织转录组分析的设计。OE活检：n=3，RE活检：n=3。(C)火山图对应于差异表达分析，显示表达式折叠变化和相关的调整p值(∗∗∗∗：P值≤0.0001；∗：0.01 <P值为≤0.0 5；ns：各基因在嗅上皮与呼吸上皮之间无显著性差异(p>0.0 5)。(D-G)嗅觉和呼吸活检中与(D)OR基因、(E)嗅觉感觉上皮标记物和(F和G)SARS-CoV-2进入蛋白相对应的转录定量。
因此在进行任何细胞类型分析之前，研究者监测了是否存在同时转录ACE2和TMPRSS2两者的细胞(图2a)。然后，根据最新发表的数据集，对28,726个单细胞进行了聚合分析，生成了一个UMAP降维图，它允许在原始呈现的报告显示26种不同细胞类型集群，包括嗅觉、呼吸和免疫细胞(图2B)。然后分别鉴定了所有的细胞ACE2, TMPRSS2，ERMN(嗅觉支持性细胞标记物)和GSTA2(呼吸道纤毛及上皮细胞的标记物)的表达(图2C，2E，2H和2I)，以及两者共同表达的ACE2和TMPRSS2(图2D、2H和2i)。嗅感觉神经元很少或不表达ACE2和TMPRSS2(图2c)。相反，不同类型的呼吸细胞和嗅觉支持细胞表达ACE2，其中许多细胞也共表达TMPRSS2。为了更好地评价ACE2和TMPRSS2在不同细胞群体中的共表达水平，研究者绘制了对应于这些亚群的ACE2和TMPRSS2的平均标准化表达水平(图2E)，发现支持细胞和纤毛呼吸细胞均表现出最高水平的表达。含嗅觉细胞、微绒毛细胞和鲍曼腺体的群体也显示了这两种基因的转录，虽然水平较低。为了更好地评估表达ACE2和TMPRSS2最高水平的两种细胞类型内的不同表达水平，研究者绘制了两种细胞类型在所有细胞中的标准化转录水平分布情况(图2F和2G)。最后，估算细胞表达ACE2、TMPRSS2或这两种基因的数字(图2H)和百分比(图2I)。
图2.ACE2和TMPRSS2在人支持和呼吸纤毛细胞中的共表达。(A)小提琴图显示ACE 2和TMPRSS 2在所有ACE2阳性(n=169)和ACE2阴性(n=28，557)细胞中的正常表达水平。(B) Durante 等人.(2020)在UMAP图上报告的聚类结果的可视化。(C) 在UMAP图上显示ACE2, TMPRSS2, ERMN（一种支持细胞基因标记）和GSTA2（一种呼吸纤毛细胞基因标记）的正常表达水平。(D)ACE2和TMPRSS2共表达细胞，在 UMAP图上以黑色突出显示。(E)ACE2和TMPRSS2在不同细胞簇(n=26簇)中的共表达)。绘制了ACE 2和TMPRSS 2正常表达水平的均值。(F和G)小提琴图显示ACE2和TMPRSS2在(F)ACE2阳性(n=71)和ACE2阴性(n=3，011)支持细胞中的正常表达水平，以及(G)ACE2阳性(n=19)和ACE2阴性(n=567)呼吸纤毛细胞中的表达水平。(H)每组表达ACE2和/或TMPRSS2的细胞数。(I)在所有共表达簇（即具有双阳性细胞的簇）中，每个簇表达ACE2和/或TMPRSS2的细胞百分比)。中的颜色梯度尺度和(A)、(F)和(G)中的y轴尺度在log10中。
综上，呼吸细胞不是唯一与外界接触的细胞，但它们是鼻子中涉及SARS-CoV-2进入的分子关键。而位于中枢神经系统与嗅觉腔交界处的支持细胞具有相同的特征。
2 嗅觉神经上皮中ACE2和TMPRSS2蛋白的表达
研究者首先评估了小鼠嗅觉上皮细胞ACE 2的潜在免疫反应。（图3A和3B)。为了评估抗体的特异性，研究者使用了三种不同的抗ACE2抗体，这些抗体首先被用来标记结肠和肾脏组织，其中包含先前描述过的表达ACE2的细胞类型(图S1A-S1J)。可以看到的是在嗅觉腔内，鼻腔和鼻咽导管内的呼吸上皮（图S3A-S3H)以及鼻腔内的支持细胞的一个子集(图3C-3G和S3B)有一个强烈而明确的标记。它们几乎完全位于上皮的背部，有一个相对突出的过渡区(图3H和3i)。所有抗体均在支持细胞顶端显示出标记，除了用Ab2（ACE2胞内部分，兔抗）的标记较轻微（图3D)。为了明确区分嗅觉感觉神经元和支持细胞，研究者对TUJ 1(神经元的标记物)、OMP(成熟感觉神经元的标记物)和ERMN(支持细胞的标记物)进行了分析（图3J-3M，3O，3Q，3R)。ACE2的位于支持细胞的腔内边缘，标记在其顶端部分，夹在感觉神经元TUJ1表达的纤毛和ERMN之间（图3J-3S)。研究者还检测了TMPRSS2在小鼠嗅觉上皮中的免疫反应（图3N和3P)。首先在肾脏组织中测试了两种不同的抗体（图S2)。在小鼠主要嗅觉上皮细胞中，TMPRSS2阳性，在其他几种细胞表达较弱（图3N，S2A、S2B、S2E和S2F)。
图3.小鼠嗅觉神经上皮中ACE2的表达。(A) 小鼠嗅觉系统的示意图。(B)小鼠嗅觉系统冠状部分的示意图。(C-F)用三种不同的抗ACE2抗体（红色）和阴性对照对小鼠嗅神经上皮冠状切片进行免疫染色。(G)小鼠嗅神经上皮冠状切片上ACE2（红色）免疫染色。(J)小鼠嗅神经上皮ACE2阳性部分的ACE2（红色）和神经元标记物TUJ1（绿色）的双重免疫染色。(K–N) 对ACE2（红色）和(K)神经元标记物TUJ1（绿色）进行双重免疫染色，(L)成熟嗅觉感觉神经元OMP（绿色）的标记，(M)支持细胞ERMN（绿色）和(N) TMPRSS2（绿色)的标记）。(O和P)阴性对照免疫染色，不含抗(O)ERMN和(P)TMPRSS2的一次抗体。(Q和R)双免疫染色的支持细胞标记物ERMN（红色）连同(Q)OMP和(R)TUJ1。(S)嗅觉上皮外部部分的示意图，根据(K)-(R)中所示的免疫染色，突出ACE2、TUJ1、ERMN和OMP的相对位置。TUJ 1主要存在于嗅感觉神经元的树突、轴突和躯体中，OMP主要集中在嗅感觉神经元的胞体中，而ACE2和ERMN则集中在嗅感觉神经元的顶端部分。所有免疫染色切片均用DAPI(蓝色)染色。
随后用免疫组化检测了ACE2在人鼻腔中的表达。类似于在小鼠中观察到的情况，人的神经上皮可以通过TUJ1阳性嗅觉感觉神经元的存在而区别于呼吸上皮(图4A)。沿组织顶端边缘有ERMN阳性的支持细胞(图4A和S4C-S4E)，以及缺乏Alcian蓝色标记的杯状细胞(图4B)。根据单细胞数据，在感觉上皮的支持细胞子集中观察到了ACE2的强标记（图4C-4G)。然而，在小鼠神经上皮细胞中观察到的ACE 2的顶端定位在人的神经上皮细胞中并没有发现，但是ACE 2在细胞的顶端一半处有相当的富集，且在小鼠肾脏近端小管细胞中也观察到类似的体细胞染色（图S1D)。与其在单细胞转录中的普遍性相一致，在鼻腔上皮的许多部分中观察到TMPRSS2标记（图4H，S4F和S4G)。
图4.人嗅觉神经上皮中ACE2的表达。(A和B)人呼吸上皮切片，(a)免疫染色ERMN（红色）和神经元标记TUJ1（绿色），(b)同样的切片用Alcian蓝色染色，核快速红色染色，突出感觉（左)和呼吸(右，注意杯状细胞）上皮之间的过渡。在嗅觉神经上皮（箭头）内的支持细胞顶端部分表达ERMN。(C，E)部分人嗅觉神经上皮免疫染色的ACE2（红色）和神经元标记物TUJ1（绿色）和(D)Alcian蓝染色（注意没有杯状细胞）。(F, G) 人类嗅觉神经上皮外缘的更高放大率。同一区域用有TUJ1染色(F)和无TUJ1染色(G)染色显示。细胞核用DAPI（蓝色)或快速(红色)染色。
研究者试图研究SARS-CoV-2病毒是否存在于感染该病毒的患者的支持细胞中。对2例SARS-CoV-2感染者的嗅觉感觉上皮进行了分析。发现其高度损坏，并且很大程度上与基底层分离(图S5)，阻碍了病毒颗粒在支持细胞中的潜在识别。这种损害是否是由病毒造成的，不能根据分析的少数样本来确定。但已有仓鼠上的研究显示支持细胞感染，嗅觉上皮出现大规模脱落(Bryche et al., 2020)。
3 SARS-CoV-2受体在脑内的表达
SARS-CoV(2002年流行的SARS病毒)已在人脑中观察到，因其与SARS-CoV-2在基因组与对人体组织的影响相似。因此为了探讨大脑中不同类型的细胞对SARS-CoV-2感染的潜在接受性，研究者再次评估了ACE2和TMPRSS2在小鼠和人类中枢神经系统神经元和非神经元细胞类型中的潜在共表达。
对于小鼠，利用了由两大类小鼠脑细胞组成的两个可用的单细胞RNA测序(RNA-seq)数据集。在Zeisel等人的数据集中，发现表达Ace2的细胞类型非常有限 (图5A)。这些细胞与周细胞有关，并共同表达壁细胞标记物Rgs5 (图5B)。转录本几乎没有被检测到的Tmprss2在更少的细胞类型中表达(图5(A)，其中Purkinje细胞表达水平最高。Saunders等人的数据集证实了这些观察结果，其中壁细胞是Ace2表达的主要细胞类型 (图5C)。这些细胞群中没有一个共表达Tmprss2。虽然数据显示ACE 2在小鼠大脑中有大量的表达，但ACE2没有如前人所述一样在中枢神经系统中广泛表达。为了准确评价ACE 2在小鼠脑组织中的表达，特别是在嗅感觉神经上皮的交界处，研究者用三种不同的抗ACE2抗体对小鼠嗅球切片进行了免疫染色。在嗅球的不同层观察到毛细血管相关细胞的强烈标记（图5D-5H)，与单细胞RNA-seq观察结果一致。
图5.小鼠脑中Ace2和Tmprss2的表达。(A)来自zeisel等人（2018年）的小鼠脑细胞类型分类通过http://mousebrain.org/直观化。树下阴影框的行表示每个细胞类型相对于其最大值的基因平均表达水平。(B)周细胞中基因表达水平的细节((a)中分类树状图的蓝色边缘)。圆盘代表平均相对表达水平。将Rgs5 和Ace2的平均正常表达水平的最大值连接到相应的圆圈(C)http://dropviz.org/数据集中前10个表达ACE2的细胞群体中的Ace2和Tmprss2表达水平(Saunders等人，2018年)。括号中的缩写表示原始大脑结构。纹状体；HC，海马；PC，后皮质；FC，额叶皮质；GP，苍白球；CB，小脑；TH，丘脑；SN，黑质；ENT，脚内核。(D)类似于图3，随后的面板显示冠状切片（蓝色区域）穿过鼻腔和嗅球。如本原理图所示，来自嗅觉上皮的嗅觉感觉神经元通过筛骨的筛状板沿神经层向嗅球发送轴突投射。OB,嗅球；OE，嗅觉上皮；nl，神经层；gl，肾小球层；ml，僧帽细胞层；gr，颗粒细胞层。(E-G)对小鼠嗅球切片上的ACE2（红色）和神经元标记TUJ1（绿色）进行免疫染色。白色箭头表示毛细血管周细胞中存在ACE2。(H)毛细血管ACE2免疫染色（红色)放大。标尺，5μm。所有切片均用DAPI（蓝色)染色。
最后，研究者探索了两个单核RNA-seq数据集来评估Ace2在人脑中的表达。在Lake 的数据集中，研究者发现神经元和胶质细胞类型，特别是Purkinje神经元和小脑星形胶质细胞，表达ACE2和TMPRSS2。在Allen脑图细胞类型数据库中公开可用的数据集中，研究者找到了ACE2(虽然处于相对有限的水平)在各种非神经元和神经元类型，特别是星形胶质细胞，少突胶细胞，以及来自皮层第5层的神经元(图6A-6G)，其中一部分共表达TMPRSS2(图6C-6E)。因此，ACE2和TMPRSS2在人脑的许多细胞类型中都有表达。
图6. ACE2和TMPRSS2在人脑中的共表达。(A)在t分布随机邻嵌入(t-SNE)图上显示人脑细胞类型子类。(B和C)在t-SNE图上显示的(B)RBFOX3(编码神经元标记NEUN),(c)ACE2和TMPRSS2的常态表达水平。(D)ACE2和TMPRSS2共表达细胞，在t-SNE图上以黑色突出显示。(E)ACE2和TMPRSS2在不同子类中的共表达(n=19个子类)。绘制了ACE2和TMPRSS2常态表达水平的均值。(F)每个子类表达ACE2和/或TMPRSS2的细胞数。(G)表达ACE2和TMPRSS2的每个子类在所有共同表达的子类（即具有双阳性细胞的子类)中的百分比。(B)和(C)中的颜色梯度尺度在log10中。
结论
本研究采取一种多学科的方法，基于自身和公开的RNA-seq数据集，以及小鼠和人体组织的免疫组化染色，证明了嗅觉神经上皮中的嗅觉支持细胞的一个子集而非嗅觉感觉神经元，表达SARS-CoV-2结合和进入人类细胞的主要参与者ACE2。这些细胞被发现共同表达TMPRSS2（已知有助于病毒进入一种丝氨酸蛋白酶）。另外本研究还发现ACE2在大脑包括神经元和非神经元细胞类型的特定细胞类型中的表达。但本研究分析的两名已死亡的SARS-CoV-2感染者的嗅觉感觉上皮，其高度受损，并且很大程度上与基底板分离，阻碍了病毒颗粒在支持细胞中的潜在识别。因此，本研究无法确定SARS-CoV-2病毒是否确实存在于感染患者的支持细胞中。不能根据所分析的少数样本来确定组织学损伤是否是由病毒引起的。
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