科研 | 中国农业大学：葡萄酒长时间陈酿过程中花青素衍生物的靶向代谢组学：进化、颜色贡献和老化预测（国人佳作）
编译：萌依依，编辑：Tracy、江舜尧。
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我们采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)和CIELAB方法研究了234种不同年份红葡萄酒的花色苷衍生物和色泽特征。K-均值聚类分析表明，不同花色素衍生物的进化模式不同，其稳定性顺序为：品诺苷>黄烷基吡喃花青素，维生素A>单体花青素，直接花青素-黄烷醇缩合产物>维生素B，花青素乙基连接黄烷醇-3醇产物。在所检测到的花色苷衍生物中，随着葡萄酒陈化时间的延长，大多数吡喃花青素的比例变得更为显著，而与黄烷醇相关的花色苷衍生物的比例急剧下降。PLSR分析表明，陈化黄褐色的特性除与vitisinB有关外，与吡喃花青素有关，尤其与pinotins有关，而单体花青素和黄醇相关衍生物(黄烷基-吡喃花青素除外)则形成红色紫色，而陈化色密度与vitisinA和黄烷基吡喃花青素的含量有较大关系，基于随机森林和支持向量机器的预测模型对葡萄酒陈化程度的预测效果较好。
论文ID
实验设计
实验结果
1.花青素衍生物的鉴定
我们以32种主要的红葡萄酒花青素衍生物作为目标，根据结构可分为6大类：维生素A苷、皮诺苷、黄烷基吡喃花青素、直接花青素黄烷醇缩合产物和花青素乙基化黄烷醇3醇。我们还检测了这些化合物的酰化形式衍生物(即6-O-乙酰基和香豆酰基糖衍生物)，以及用于比较花色苷衍生物动态演化模式的MV-GLC(记为A) （图1）。
图1 本研究中靶向分析的花青素衍生物的种类
2. 葡萄酒陈化过程中色泽特性和花色苷衍生物的演化
为了获得葡萄酒陈化过程中色泽特征和花色苷衍生物的内在特征和相似性，我们对数据进行归一化处理，然后进行K-均值聚类分析，图2分别展示了每个簇中的成分及其在老化过程中的演化。如图2所示，同一类别的花色苷衍生物无一例外地聚在一起，这表明不同类别的花色苷衍生物之间存在着独特的进化模式。
这些差异(和相似之处)可能归因于它们的形成能力，如前体的水平、内在的反应机理等，以及衍生色素在葡萄酒陈化环境中的稳定性。
图2 基于K-means聚类分析的葡萄酒陈酿过程中颜色参数、花青素及花青素衍生物的进化聚类图
Cluster1由单体MV-GLC和直接花青素-3-醇缩合产物组成，包括A-F和F-A(图2)，这表明它们在葡萄酒陈酿过程中有类似的进化模式。由花色苷产生的直接花青素-黄烷醇缩合产物已被公认为陈年红酒中的主要聚合色素和主要的稳定色素；然而，如数据所示(图2和补充材料中的S4)，这些特殊的花色苷衍生物如MV-GLC的分布可能会随着时间的推移而大大减少。
值得注意的是，我们只检测到单体和二聚黄烷-3-醇缩合的花青素，而不是所有潜在的单宁-花青素聚合物。由于色素分子中含有更多的黄醇单元，会引入更多的还原位点，使得色素分子不稳定，容易被氧化；同时，在酸催化下，黄烷醇单元间的黄烷键断裂可能会减少分子的数量，并且由于大单宁分子结合的溶解度降低，更有可能发生长链花青素-单宁的沉淀。因此，这项研究的结果表明，直接单宁-花青素缩合产物，特别是F-A型，容易像单体花青素一样随着时间的推移而下降，在葡萄酒陈酿过程中不太容易积累。
在Cluster 2中，三个色度参数L*、b*和hab被分组在一起，即图2。在葡萄酒陈酿过程中，这三种物质都有所增加(图3)，表明在红酒陈酿过程中，颜色密度下降，紫色色调丧失，黄褐色色调积累。在其他葡萄酒老化和长时间老化的研究中，我们也观察到了葡萄酒色调的逐渐增加和颜色密度的下降的现象。
在Cluster 3中有两类花色苷衍生物，即A-e-F和Vitisin B，它们的含量在浅龄葡萄酒中最高，在五年内急剧下降，此后一直保持在较低水平(图2和补充材料中的S6)，可以看出，这两类色素的形成涉及乙醛的直接参与。发酵过程中酵母代谢的活动，以及橡木桶陈化过程中的微氧环境会促使乙醛的积累，进而促进A-e-F和Vitisin B的形成和积累。至于稳定性，A-e-F在水溶液中比花色苷更容易降解；此外，VitisinB只对SO2有部分抗性而且其稳定性不如花青素，其可被认为是本研究中最不稳定的色素。
Vitisin A和A-v-F与显色参数a*和C*ab一起聚成Cluster4(图2)，这些化合物在葡萄酒陈酿过程中的演变显示出减少的趋势(图2和补充材料中的S7)。与第一类和第二类相比，它们的下降速度可能要慢得多，这可能归因于它们在葡萄酒环境中的稳定性，维生素A和A-V-F都显示出对SO2攻击的完全抵抗力。
在第Cluster 5中，所有的Pinotins都聚集在一起，通常随着葡萄酒年龄的变化显示出相对稳定的水平(图2和补充材料中的S8)，尽管有一些明显的下降。Pinotins和其他吡喃花青素在红酒的pH范围内不会发生水合反应；此外，花青素分子中C4位的吡喃环的取代使得吡喃花青素更容易被SO2漂白，虽然属于吡喃花青素类，但Pinotins表现出比Vitisin A更好的稳定性。
3 花色苷衍生物在葡萄酒陈化过程中的颜色贡献
3.1 花色苷衍生物比例的演变
红酒的颜色是所有成分光谱特征的组合。为了研究特定类别的花青素衍生物的颜色贡献，根据以往研究，我们考虑了各物质间的比例而不是浓度，花色苷衍生物比例的演化在图3所示。这些物质根据层次聚类被分为三个不同的簇，每个簇中的成分具有独特的特征，总体而言，第1类成分在较年轻的葡萄酒(1-4年)中所占比例较大，第2类葡萄酒的色素含量较高，随着陈化时间的延长(4-12年)，第3类葡萄酒的比例最高(大多超过10年)。据报道，MV-e-(e)cat和MVC-e-(e)cat的最大吸收波长分别为543 nm和540 nm，(e)CAT-MV和Di(e)CAT-MV的最大吸收波长分别为529和530 nm，因此，它们可以被认为是低龄红葡萄酒的红紫色色调有重要贡献的色素。与MV-GLC相比，Vitisin B对短波长(490 nm)有最大的吸收，这导致了红橙色的外观；然而，与现阶段大量的单体花青素相比，VitisinB型色素对低龄红酒色调的贡献可能并不显著。
在Cluster 2中的组分是乙酰化的吡喃花青素，即乙酰化的Pinotins，以及A-v-F、维生素A和非酰化的F-A。这些数据暗示，在长时间陈酿中期(4年至10年)，这些因素可能会对葡萄酒的色泽产生重大影响，因为它们的比例更为突出(图3)。相比之下，在衰老的早期和延长阶段，它们的重要性似乎相对较小。第三类酒主要由Pinotins、A-V-F和VitisinA组成，它们的特征是比例随着酒龄的增加而增加。据报道，这些吡喃花青素在紫外光谱中的吸收波长(504-518nm)低于MV-GLC，这意味着它们具有橙色或淡黄色色调。
3.2 偏最小二乘回归分析
本研究以PLSR为回归模型，评价检测到的花色苷衍生物对葡萄酒色泽属性的贡献。最后生成了6个组件，但是为了便于图形显示，我们使用了组件1和2。基于PLSR模型的花青素衍生物的比例(X变量)和CIELAB特性(Y变量)的相关负荷曲线图可以在图4A中看到。在花色素衍生物中，hab和b*值与皮诺苷沿x轴的正侧呈正相关，说明在检测到的花色素衍生物中，Pinotins是导致花色变黄的最重要的因素。如上所述，这一结果与Pinotins形成一类红橙色色素的事实很好地吻合。Malvidin衍生物是本研究的重点，因为它们构成了红葡萄酒中的主要花色苷，但其他花青素，如飞雀素、Petunidin、芍药苷和氰化物，也可以形成一系列类似的衍生色素，具有相似的光谱和化学特性。因此，主要由花青素和羟基肉桂酸反应产生的Pinotins可以被认为是对陈年葡萄酒黄褐色特性有贡献的最重要的花青素衍生物之一；然而，这一结果仅适用于花青素类颜料的范围，并不意味着红酒的色调变化完全是由Pinotins引起的。除Pinotins外，A-v-F和维甲素A(除乙酰化形式外)关系密切，也位于x轴的正值区域，这也反映了它们对葡萄酒淡黄色色调的积极贡献。就a*值而言，它与图4A中沿x轴呈负方向的A、A-e-F、F-A和Vitisin B相关，这表明了这些化合物对红色色调的贡献；此外，我们还注意到红色色调的丧失(图2)。在葡萄酒陈酿过程中，这些化合物的比例迅速下降(图3)；此外，这些色素在b*和hab值上处于相反的方向，F-A和特别是A是最负相关的(图4A)。这表明A和F-A色素与紫罗兰色特性(即负b*值)有很
强的相关性。
图4 所有葡萄酒的偏最小二乘回归分析样本根据CIELAB参数与比例(A)和非比例(B)花青素衍生物的数据
对于L*值，应使用非比例数据，因为假定颜色密度与颜料含量直接相关，而不是它们的比例，因此我们建立了另一种PLSR模型(R2X(CUM)0.536和R2Y(CUM)0.392，Q2Y(CUM)0.289用于组分1和2)。如图4B所示，A-v-F和Vitisin A与L*值的负相关最大，这表明它们对颜色的贡献很大(即负L*值)。同时，据报道，A-v-F和Vitisin A比MV-Glc有更大的摩尔消光系数，而Pinotins以及其他类别接近图4B中的L*值(但仍呈负相关)，并暗示它们对颜色强度的贡献较小(即正L*值)。据报道，Pinotins的摩尔消光系数低于MV-GLC，A-F(A型)甚至是一种无色化合物；通过比较图4B和图4A，非比例数据得到的结果似乎更符合报道的事实。考虑它们在长时间老化后的含量(图3，S4和S8)，似乎葡萄酒的颜色密度更多地归因于维生素A、A-V-F，其次是Pinotins。
图5 花青素衍生物随红酒陈酿的颜色贡献
最后，C*ab与大多数花色苷衍生物没有很好的相关性，这可以通过将C*ab定义为a*和b*值的平方和的算术平方根来合理化，a*和b*的相反趋势意味着C*ab不会随着酒龄的变化而有很大的波动。在图4A中，Vitisin A和A-v-F与C*ab相关。Vitisin A和A-V-F的比例没有随酒龄的变化而变化很大，如图3所示，它们分布在cluster 2和cluster 3中。总之，基于以上讨论，我们可以根据花青素衍生物的贡献来概括描述葡萄酒颜色性质的变化(图5)：在红酒陈化的最开始，红紫色的色调主要归因于花青素以及F-A和A-e-F加合物(图4A)，红紫色色调的下降可能是由于花青素和F-A和A-e-F加合物的相对比例随着葡萄酒的陈酿而降低(图3，S4，S6，S7)；随着葡萄酒陈酿时间的延长，维生素A、Pinotins和A-V-F占优势，但仍有部分A和F-A(图3)，呈宝石红色，色调为淡黄色；随着陈年时间的延长，Pinotins和A-V-F取代(图3)，导致淡黄色调(图3)。
4. 基于随机森林和支持向量机的葡萄酒陈酿阶段预测模型
红酒陈化伴随着花青素组成和色泽特征的变化，无论品种、地域和酿酒工艺，都是不可避免的现象。随机森林（RF）结合了许多基于Bootstrap抽样的单线预测器进行分类，支持向量机（SVM）则利用核函数生成高维平面进行分类或回归，这两种方法是对样本的非线性特征进行分类的有力工具。因此，本研究基于花色苷衍生物的含量和葡萄酒的色泽特征，建立了基于RF和SVM的预测模型，用于预测葡萄酒的陈化阶段。
表1列出了两种预测模型的准确度和交叉验证结果。对于RF测试数据集和支持向量机SVM测试数据集，模型的准确率分别为82.91%和78.63%。表1中还以混淆矩阵的形式列出了每种分类的敏感度和特异度。在每组中，我们通过将正确分类的样本数除以该组的总样本数来计算敏感度，又通过将特定组中正确归入该组的样本数除以归入该组的任何组中的总样本数来计算特异度，两种模型的平均灵敏度均在80%以上。SVM对年轻葡萄酒和陈年葡萄酒的预测灵敏度较高(分别为97.22%和85.37%)，而RF对年轻葡萄酒和陈年葡萄酒的预测灵敏度较高(分别为85.71%和86.36%)。
两种模型的平均特异度分别为83.62%和86.04%。特别是，RF对年轻葡萄酒有较高的特异性(89.19%)，SVF对陈年葡萄酒有较高的特异性(92.73%)。值得注意的是，支持向量机对陈年葡萄酒的特异性较弱(74.47%)，这可能是由于本研究中没有应用足够的陈年特征来对陈年葡萄酒进行分类所致；也可以看出，“陈年葡萄酒”样本有时会被错误地归入相邻的组，但在两种类型的模型中，“年轻葡萄酒”样本从未被归类为“陈年葡萄酒”，反之亦然(表1)。然而，这两个机器学习模型总体上表现出了良好的预测性，特别是考虑到只使用有限的花青素衍生物和颜色特征，而不是结合其他感官特性(如香气和非酚类化合物)的综合数据，因此，这两个预测模型可以作为葡萄酒老化研究的有力工具。
结论
综上所述，我们利用花色苷衍生物的色泽特征和目标代谢策略来研究红酒的陈化过程。K-均值聚类分析和化合物分布图表明，不同种类的花色苷衍生物随酒龄的变化具有不同的分布模式，吡喃花青苷(除维生素B外)比黄烷醇类(F-A和A-e-F)花色苷衍生物更稳定。总体而言，Pinotins被认为是最稳定的色素，其次是A-v-F和Vitisin A。A-F和F-A色素的演化趋势与MV-GLC相似，而A-e-F型化合物和VitisinB的稳定性被认为比MV-GLC差。在葡萄酒陈化过程中，吡喃花青素(尤其是皮诺苷、A-v-F和维生素A)在所有被检测的花色素衍生物中的比例可能增加得更明显。PLSR分析以及颜色和化合物的演化模式表明，黄褐色色调与品诺苷、A-v-F和维生素A密切相关，而红紫色色调的丧失可以归因于单体花色苷和黄烷醇相关的花色苷衍生物(F-A和A-e-F)的丧失。因此，葡萄酒色调的变化可能与这些化合物的比例有关，而葡萄酒的颜色密度和饱和度似乎受花青素组成变化的影响较小。两种机器学习模型在预测葡萄酒陈化阶段时表现出良好的性能，显示了在葡萄酒陈化研究和真实性评估方面的潜在应用前景，这两个模型都使用了本研究中报道的色度特征和花青素衍生物来预测葡萄酒的陈化阶段。