科研 | Cancer Lett.: 北豆根苏林碱直接靶向HSP90降低β-catenin蛋白稳定性，从而抑制肺癌（国人佳作）
编译：阿温，编辑：小白、江舜尧。
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肺癌是世界上最常见的癌症，且预后较差，目前迫切需要识别新的癌症靶点和寻找有效的无毒性治疗策略。在这项研究中，我们在一个包含429个小分子的文库中筛选具有抗癌生物活性的天然产物。首次证实，北豆根的成分北豆根苏林碱通过诱导细胞周期停滞于G1期而抑制肺癌细胞的增殖。此外，还发现北豆根苏林碱不仅能抑制肺异种移植瘤在动物体内的生长，还能抑制细胞的迁移和侵袭，且无明显副作用。定量蛋白组学和生物信息学分析、Western blotting和qRT-PCR证实，北豆根苏林碱通过抑制β-catenin及其下游靶点c-myc和cyclin D1的表达来发挥其抗癌作用。此外，利用(DARTS)技术、(ITC)和一系列功能测定中得到的数据表明，北豆根苏林碱可以直接靶向HSP90并破坏其与β-catenin的相互作用，从而增加β-catenin的泛素-蛋白酶体降解。本研究表明北豆根苏林碱可能是一种很有前途的肺癌治疗药物。
论文ID
实验设计
1. 小分子药物库筛选有效的抗癌药物，确定了北豆根苏林碱；
实验结果
1. 通过对药食同源性小分子文库的筛选，确定了北豆根苏林碱是一种新型的抗癌化合物
为了寻找新的癌症治疗药物，研究初步筛选了一个由429种天然产物组成的小分子文库，并选择了54种罕见的具有抗癌生物活性的化合物进行功能实验。54个化合物(10 μM)分别作用于3株肺癌细胞株A549、Hop62和H1299，用WST-1测定各化合物的抑制作用。如图1A-C所示，从中药北豆根中提取的天然产物北豆根苏林碱是抑制肺癌细胞增殖最有效的化合物(图1D)。为了验证北豆根苏林碱在肺癌中的抗增殖活性，不同浓度北豆根苏林碱处理A549和Hop62细胞，结果显示北豆根苏林碱对肺癌细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性(图1E)。此外，克隆形成实验数据显示，北豆根苏林碱以剂量依赖的方式显著减少肺癌细胞形成的集落数量(图1F)。有趣的是，北豆根苏林碱对正常肺上皮细胞未见毒性作用(图1G)。综上所述，这些结果表明北豆根苏林碱可能是一种潜在的抑制肺癌细胞增殖的药物。
(A-C) 54种化合物(10 μM) 分别治疗A549、Hop62和H1299细胞48小时，用WST-1测定细胞活力；(D) 北豆根苏林碱的化学结构；(E)WST-1测定A549和Hop62细胞经北豆根苏林碱治疗后的细胞存活率；(F) 北豆根苏林碱抑制A549和Hop62细胞的克隆形成能力；(G) WST-1测定北豆根苏林碱治疗正常肺上皮细胞HBE 的细胞存活率。
2. 北豆根苏林碱诱导肺癌细胞的G1期细胞周期阻滞
我们检测了北豆根苏林碱对细胞周期分布的影响，流式细胞仪分析显示，北豆根苏林碱处理的A549和Hop62细胞在G1期有显著的积累(图2A和B)。由于细胞死亡也会导致细胞增殖迟缓，所以对北豆根苏林碱处理的A549和Hop62细胞进行Annexin V-FITC/PI染色检测。如图2C所示, 北豆根苏林碱均不能诱导肺癌细胞明显凋亡或坏死。这些数据表明，北豆根苏林碱抑制肺癌细胞增殖是通过诱导细胞周期阻滞而不是细胞死亡来实现的。
图2 北豆根苏林碱诱导细胞周期阻滞在G1期
(A-B)流式细胞仪分析北豆根苏林碱治疗A549和Hop62后的细胞周期分布；统计G1、S、G2/M期细胞百分比；(C) Annexin V-FITC/PI双染色法检测凋亡细胞。
3. 定量蛋白组学和生物信息学分析表明，北豆根苏林碱引起β-catenin信号通路异常
数据独立采集(DIA)质谱(MS)是一种无标签的定量方法，提供了更一致的肽检测和准确的蛋白组定量。为了探讨北豆根苏林碱诱导G1期阻滞的潜在机制，定量蛋白组学检测北豆根苏林碱处理A549细胞48小时的蛋白组变化。收集细胞总蛋白，用胰蛋白酶消化，进行质谱分析(图3A)。我们使用全局误差模型(PLGEM)算法来识别差异表达蛋白。蛋白丰度分析的斜率为0.678，调整后的r2为0.966(图3 b)。残差分布均匀，独立于平均丰度(图3C和D)。Q-Q图结果显示，模型值与实际值之间的残差标准差呈拟合正态分布(图3E)。差异表达蛋白的网络分析表明，β-catenin信号通路在介导北豆根苏林碱的抗癌作用中发挥枢纽作用(图3F)，β-catenin是c-myc和cyclin D1的转录调控因子，调节G1/S细胞周期进展。为了证实这一假设，我们采用Western blot方法检测了北豆根苏林碱处理的肺癌细胞中β-catenin、c-myc和cyclin D1的表达水平，结果显示北豆根苏林碱在蛋白水平上显著降低了β-catenin、c-myc和cyclin D1的表达(图3G)。此外，北豆根苏林碱处理下调了c-myc和cyclin D1的mRNA表达(图3H)。这些结果表明，北豆根苏林碱阻滞肺癌细胞周期的作用中，β-catenin通路起着关键作用。
图3 定量蛋白组学和生物信息学揭示β-catenin信号通路参与北豆根苏林碱的作用机制
(A) DIA质谱分析鉴定北豆根苏林碱调控蛋白的技术原理图；(B)使用PLGEM模型来拟合北豆根苏林碱调控蛋白的丰度；(C)被鉴定蛋白的残差直方图；(D)残差分布随平均丰度的排序；(E)残差与标准的Q-Q图；(F) 北豆根苏林碱调控蛋白的IPA分析提示了β-catenin信号通路的失调；(G) Western blot检测β-catenin、c-myc和cyclin D1的表达；(H) qRT-PCR检测c-myc和cyclin D1的mRNA表达水平
4. 北豆根苏林碱直接与HSP90结合，破坏HSP90和β-catenin之间的相互作用
为了研究肺癌细胞中北豆根苏林碱灭活的分子机制，我们利用DARTS技术确定了北豆根苏林碱的直接靶点。将A549细胞中相同数量的细胞裂解液与不同浓度的北豆根苏林碱(最高40 μM)混合3小时，然后与蛋白酶K在室温下孵育30分钟。然后将样品加载到SDS-PAGE凝胶上，用考马斯亮蓝染色。如图4A所示，在北豆根苏林碱治疗的细胞裂解液中发现了一个大小约为90 kda的特异性蛋白条带以剂量依赖的方式增加，经质谱鉴定为HSP90。我们纯化了HSP90蛋白，进一步的ITC研究证实北豆根苏林碱可以直接与HSP90结合(图4B)。这些数据使我们提出HSP90可能是介导北豆根苏林碱抗癌作用的直接靶点。之前有研究报道HSP90参与了乳腺癌细胞中β-catenin降解的调控，但其机制尚不清楚。我们假设β-catenin是HSP90的互作蛋白，而北豆根苏林碱可能破坏这种相互作用。通过免疫沉淀验证了A549和Hop62细胞中HSP90和β-catenin的相互作用(图4C)，更重要的是，我们观察到北豆根苏林碱减弱了这种相互作用。值得注意的是，HSP90的表达在北豆根苏林碱存在时没有变化(图4C)。β-catenin是通过泛素化蛋白酶体降解，我们在肺癌细胞中通过免疫沉淀反应比较有或没有北豆根苏林碱治疗时的β-catenin泛素化，β-catenin在A549和Hop62细胞中泛素水平增加(图4D)，这表明北豆根苏林碱可能增加β-catenin蛋白降解。此外，将蛋白酶体抑制剂MG132添加到北豆根苏林碱治疗的细胞中，Western blot数据显示，MG132可明显逆转北豆根苏林碱诱导的β-catenin下调及其下游靶点c-myc和cyclin D1的下调(图4E)。此外，我们测定了北豆根苏林碱诱导的β-catenin降解对肺癌细胞增殖的影响，如图4G所示，MG132处理可以明显消除北豆根苏林碱诱导的增殖抑制作用。综上所述，我们证明了北豆根苏林碱可以直接靶向HSP90，破坏β-catenin和HSP90的相互作用，破坏β-catenin蛋白稳定性，下调其下游靶基因c-myc和cyclin D1，从而诱导G1细胞周期阻滞而抑制肺癌细胞增殖(图7)。
图4 北豆根苏林碱直接与HSP90结合，破坏HSP90和β-catenin之间的相互作用
(A) DARTS技术原理图及HSP90作为靶蛋白的质谱鉴定；(B) ITC实验显示北豆根苏林碱与HSP90结合；(C)免疫沉淀检测β-catenin和HSP90的相互作用；(D) 北豆根苏林碱治疗A549和Hop62细胞后，用β-catenin抗体免疫沉淀整个细胞裂解液，通过Western blot检测泛素的表达；(E)在MG132不存在或存在的情况下，用北豆根苏林碱处理A549和Hop62细胞，然后分别用Western blot和WST-1法检测β-catenin、c-myc和cyclin D1的表达水平(F)和细胞活力(G)。
5. 北豆根苏林碱抑制肺癌细胞的迁移和侵袭
接下来我们检查了北豆根苏林碱对癌细胞迁移和侵袭的影响。用北豆根苏林碱处理A549和Hop62细胞进行细胞迁移和侵袭实验。如图5A和B所示，北豆根苏林碱显著抑制了A549和Hop62的细胞迁移和侵袭能力。此外，Western blot数据显示，北豆根苏林碱降低了EMT标志物如纤连蛋白、N-cadherin和vimentin的表达水平(图5C)。这些结果表明，北豆根苏林碱可以抑制肺癌细胞的转移能力。
图5 Daurisoline抑制肺癌细胞的迁移和侵袭
(A-B)北豆根苏林碱处理A549和Hop62细胞后，测定细胞迁移(A)和侵袭(B)；(C)北豆根苏林碱处理A549和Hop62细胞24小时后，Western blot检测纤维连接蛋白、N-cadherin和vimentin的表达。
6. 北豆根苏林碱抑制肺肿瘤的体内生长
将A549细胞皮下注射到裸鼠侧翼，以评价北豆根苏林碱治疗癌症的潜力。当肿瘤直径达到约0.5 cm时，随机分为三组，每两天给予北豆根苏林碱(20 mg/kg、40 mg/kg)或对照剂。在接受20 mg/kg和40 mg/kg北豆根苏林碱治疗的两组中，肿瘤体积分别减少了34.5%和61.2% (图6A和B)。肿瘤移植瘤的Western blot分析表明北豆根苏林碱明显抑制β-catenin、c-myc和cyclin D1表达水平(图6C)，这符合体外实验结果(图3)。此外，治疗组与对照组在体重(图6D)和血清ALT、AST水平(图6E)方面均无明显差异。肺、肝脏和肾脏的组织学检查没有显示任何明显的形态学变化(图6F)，说明北豆根苏林碱是一种具有强治疗效果和安全性的潜在抗癌药物。
图6 北豆根苏林碱抑制肺肿瘤的体内生长
(A)肿瘤图像(B)肿瘤曲线显示，北豆根苏林碱对A549来源的异种移植瘤有明显的抑制作用；(C) Western blot检测肿瘤中β-catenin、cyclin D1和c-myc的表达水平；(D)实验期间裸鼠体重；(E) 北豆根苏林碱处理小鼠血清ALT和AST水平与对照组比较；(F)苏木精和伊红(H&E)染色小鼠的肺、肝、肾。
图7 概述北豆根苏林碱在癌细胞中的作用机制的示意图。
讨论
HSP90是热休克蛋白家族的一员，在所有真核生物和原核生物中都大量存在，在多种细胞功能中发挥重要作用，包括调节正常生理过程所需的关键转录因子和激酶的稳定性。HSP90通常在癌细胞中过表达，参与各种恶性表型的生物学过程，成为癌症治疗的有效靶点。在ATP/ADP依赖的伴侣周期中，HSP90通过与几个辅伴侣蛋白合作，发挥其伴侣蛋白活性。HSP90与服务蛋白的N端结构域结合ATP，与服务蛋白形成封闭构象，而C端结构域和中间结构域分别负责与二聚体和服务蛋白的结合。目前已开发的HSP90抑制剂大多以HSP90的N端结构域为靶点，影响ATP酶活性或ATP结合袋。在这里，通过DARTS和ITC实验，我们发现北豆根苏林碱直接与HSP90结合，并阻断了其对β-catenin蛋白稳定性的影响(图4)，说明北豆根苏林碱作为一种新的HSP90抑制剂的潜在能力。由于我们的数据显示，北豆根苏林碱可以抑制HSP90和β-catenin的相互作用而没有任何副作用，我们猜测北豆根苏林碱可能靶向HSP90的N末端结构域，这需要进一步的研究证明。
天然产物因其疗效显著、毒性低而成为筛选抗肿瘤药物的丰富来源。FDA批准的几种用于治疗癌症的临床药物最初是从天然产物中分离和开发的，如阿糖胞苷和曲贝替定。阿糖胞苷从黑斑干蘑菇中分离出来，是治疗急性髓系白血病最有效的药物之一，通过抑制DNA合成，特别是细胞周期S期，从而抑制肿瘤的发展。曲贝替定也是一种源自于鼻甲外鞘的天然剂，可抑制DNA修复蛋白的反式激活和相互作用，已被用于治疗软组织肉瘤和卵巢癌。本研究通过对一个含有429种天然化合物的小分子库的高通量筛选，确定了北豆根苏林碱是一种新型的抗癌药物。我们的研究结果显示，在体内和体外实验中，北豆根苏林碱以剂量依赖和时间依赖的方式对肺癌细胞的增殖和肿瘤生长具有显著的抑制作用(图1和6)。通过使用定量蛋白质组学、生物信息学分析和一系列的功能分析，我们证明了北豆根苏林碱可以减少β-catenin及其下游靶基因c-myc和cyclin D1表达(图2和3)，因此诱导肺癌细胞的细胞周期阻滞在G1。更重要的是，北豆根苏林碱治疗不影响体重、器官形态或血清ALT和AST水平(图6)，突出其安全性优势，这对药物开发非常重要。
肺癌是世界上最严重的恶性肿瘤之一，占所有癌症病例的11.6%，占癌症死亡的18.4%。肺癌不受控制的扩散和转移加速了癌症的进展，导致癌症患者预后不良。手术联合术后化疗、放疗仍是目前临床癌症患者的标准治疗方法。虽然辅助治疗可以改善治疗结果，特别是随着靶向治疗方法的发展，如拉帕替尼、吉非替尼等分别阻断HER2和EGFR信号通路，肿瘤可以对这些药物产生抗药性，治疗一段时间，导致癌症的复发和转移。因此，肺癌治疗迫切需要新靶点的识别和有效药物的开发。我们的结果表明，北豆根苏林碱不仅在体内外抑制肺癌的发生，而且抑制了肺癌细胞的转移潜能。在分子水平上，北豆根苏林碱显著降低了纤连蛋白、N-cadherin、vimentin等EMT标志物，提示北豆根苏林碱可以逆转上皮-间充质转化。这些结果说明HSP90和β-catenin可以作为治疗靶点，并暗示北豆根苏林碱在肺癌预防和治疗中的作用。
结论
总之，我们首次发现，北豆根苏林碱通过直接靶向HSP90在体外和体内显著抑制肺癌的发展，且无副作用。北豆根苏林碱作为一种新型的HSP90抑制剂，可能破坏HSP90和β-catenin之间的相互作用，降低β-catenin蛋白稳定性，下调其下游基因c-myc和cyclin D1的表达水平，从而导致细胞周期阻滞在G1期。这些数据表明北豆根苏林碱可以作为一种新的癌症治疗药物。