CRISPR-Cas9基因敲除技术原理

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原核生物的“免疫系统”

人体有着一套复杂且高效的免疫系统，时刻保护着我们免受病毒和细菌的攻击。但是，对于弱小又无助的原核细胞而言，它们也是急切需要被保护的。为此，经过几亿年的进化，细菌和大部分古细菌衍生出了CRISPR-Cas系统，用于保护它们免受外源DNA和噬菌体的侵染。到目前为止，科学家们发现50%的细菌和超过90%的古细菌均携带有CRISPR-Cas系统。CRISPR是一段高度重复的DNA序列，两端重复序列之间存在着各不相同的spacer序列，表达Cas蛋白家族的基因簇位于CRISPR位点的上游，其表达翻译的几种类型的Cas蛋白作为原核生物免疫应答的效应器发挥着重要作用。

当细菌受到噬菌体的侵染时，被释放到细菌细胞质中的噬菌体基因组的某段DNA序列被识别并整合到CRISPR的spacer区域，随后转录出相应的crRNA前体（pre-crRNA）。crRNA前体经过修饰和加工，生成向导RNA（guide-RNA）。由于gRNA中存在一段来源于噬菌体基因组的序列，因此gRNA可以通过碱基的互补配对原则识别噬菌体的基因组。同时存在于细胞质中的gRNA和Cas蛋白特异性结合，并靶向到噬菌体基因组参与DNA的切割与降解。

CRISPR-Cas9技术

简单来讲，CRISPR-Cas9是一种分子生物学技术，通过这种技术科研人员可以对细胞和生物体内的基因进行编辑。所谓的基因编辑就是通过某种生物手段和技术，对生物体内的遗传物质进行修改。

基于原核生物的获得性免疫系统研发出的CRISPR-Cas9技术只包含两种重要的成分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的sgRNA（single guide RNA）。当细胞内同时表达sgRNA和Cas9蛋白时，Cas9蛋白通过与sgRNA结合，靶向到目的DNA序列上发挥DNA双链切割的功能。DNA序列被切割产生断裂后，引发细胞内部的DNA修复机制（DNA repair）。真核细胞同时存在着同源重组修复和非同源重组修复。在同源重组修复下，断裂的染色体以另一条完整的姐妹染色单体为模板进行DNA修复，而在非同源重组修复下，断裂出的DNA随机修复，引入新的碱基，使基因产生移码突变。

基于CRISPR-Cas9的基因敲除

CRISPR-Cas9其中一种最为重要且广泛的应用便是基因敲除。

那么，基因敲除又是什么呢？

从很久以前，生物学家们就热衷于一种研究策略，那就是功能缺失策略（loss of function）。常规的理解是这样的，当我们想要去研究某个基因在整个基因组中的作用时，只需要通过某种方法将这个基因从基因组中剔除，然后观察去除这个基因之后，这个细胞或生物体会发生怎样的变化，然后根据这些变化去推断这个基因的功能。基因敲除就是用来描述将某个或某些基因从基因组中剔除这件事，而基因敲除技术则是用于完成这件事的方法或技术。

那又该如何实现基因敲除呢？

在实际实验过程中，我们只需要将Cas9蛋白和设计好的gRNA同时“运送”进细胞中即可，接下来的就交给细胞自己去操作了。

那么，对于转导gRNA和Cas蛋白的常见方法主要有四种：

1）RNP法。直接将大量的gRNA和Cas9蛋白，通过电转的方式转染目的细胞

2）病毒法。构建慢病毒（LV）敲除质粒，经病毒包装和纯化后转染细胞，将sgRNA和Cas9蛋白元件整合到细胞基因组中，从而使细胞源源不断地生产sgRNA和Cas9蛋白。

3）常规质粒法。构建常规敲除质粒，通过电转将其导入细胞，短时间内表达gRNA和Cas9蛋白。

4）转座子法（PiggyBac）。将携带有PB转座子和piggyBac转座酶(PBase)的质粒共转染细胞，转座酶促进转座，将高拷贝的Cas9蛋白和gRNA表达元件随机整合到基因组，实现gRNA和Cas9蛋白的持续表达。

这四种方法各有优劣，我们在选择时可根据所研究的靶基因及靶细胞的特性，选取适合自己研究要求的方法。这期的分享就到此为止，相信看到这大家对CRISPR-Cas9技术已经有了不错的理解。