治疗性蛋白药物的免疫原性是指治疗性蛋白和/或其代谢物诱发对自身或相关蛋白免疫应答或免疫相关事件的能力。免疫反应的产生影响广泛，从无临床意义抗药抗体的暂时出现，到能够改变药物药效或产生副作用，甚至严重到危及生命，因此免疫原性研究一直是药物研发的重要组成部分，贯穿药物研发-非临床研究-临床研究-上市后药物监测的整个生命周期。药物免疫原性研究有利于优化药物临床使用方案，提高药物的临床应用范围，降低副作用，甚至决定了药物研究的成败。
免疫原性研究一直是药物评价的一个难点，涉及免疫学、药理学、毒理学、临床医学、统计学等多个学科，存在研究内容多，机理复杂，成熟实验方法少，业界认识不统一等诸多问题。本文就治疗性蛋白药物免疫原性的分析进行简单梳理。
治疗性蛋白引起的机体免疫反应既包括固有免疫又包括适应性免疫（细胞免疫和体液免疫）。固有免疫主要由微生物污染等导致，一般讨论较少，更多的是对于治疗性蛋白的适应性免疫反应的讨论与监测。适应性免疫既包括细胞免疫介导的细胞因子释放作用，又包含体液免疫介导的抗药抗体的产生。
图1 FDA关于治疗性蛋白免疫原性产生机制的示意图
细胞免疫一般过程包括T细胞的分化以及细胞因子的释放，可以引起不同T细胞亚型的比例的变化和外周细胞因子水平的变化。体液免疫主要通过B细胞产生的针对治疗性蛋白的抗药抗体（anti-drug antibodies, ADAs）来发挥作用。抗药抗体不仅包括结合药物的抗体（binding antibodies，BAbs），也可以是阻断其功能的中和抗体（neutralizing ADAs，NAb）。根据产生机制通常可分为T细胞依赖途径和非T细胞依赖两种机制。实际上，由于免疫复合物或者聚集物都能够从不同程度上激活这两种途径，并且，两种途径均会产生ADA，使得这两种机制并无明显区别，并且，它们会相互作用，相互增加对方的作用强度。
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T细胞依赖途径
T细胞依赖途径产生的免疫应答以强度高和持续时间长为特征，这种应答启动后，体内的记忆细胞会在机体再次遇到相同的抗原时产生免疫反应。当抗原侵入机体，抗原呈递细胞（antigen presenting cells, APCs）通过吞噬或者胞饮作用，将蛋白降解为线性抗原多肽片段。体内重要的抗原呈递细胞有树突状细胞（inhibitory dendritic cells, iDCs）、巨噬细胞、B细胞。T细胞活化需要CD4+辅助，且需要双信号的共同激活：抗原多肽与主要组织相容性II类分子（major histocompatibility complex-2, MHC-II）结合形成MHC II-抗原多肽复合物，表达于APCs表面，供TCR识别和结合；这个过程需要APCs表面的共刺激分子（如CD86或CD80）同时与T细胞表面的协同刺激分子（如CD28）结合。被激活的T细胞发生增殖，分泌特异的细胞因子激活B细胞，B细胞增殖分化，分泌ADA。最初形成的是具有低亲和力的IgM型ADA。随着B细胞持续分化，在细胞因子的参与下，ADA可发生类别转换，产生IgG、IgA、或者IgE型ADA。IgG型ADA与药物具有较高的亲和力，是最典型、最常见的ADA类型。此外，在T细胞依赖途径中，少数B细胞会分化为具有较长记忆功能的记忆性B细胞，当在机体再次遇到相同抗原刺激时分泌抗体。
非T细胞依赖途径
无T细胞参与，机体针对治疗蛋白聚集物也可以产生ADA，即非T细胞依赖途径。呈多聚体结构的药物或ADAs免疫复合物可以直接与B细胞表面受体（B cell receptors , BCR）结合，使BCR发生低聚化、内化，激活B细胞，促使B细胞分化和增殖，产生ADA。没有T细胞辅助，该途径产生的ADA不会发生类别转换，所以该途径分泌的ADA主要IgM型，亲和力低、持续时间短、特异性差，且不如T细胞依赖的免疫应答作用强。此外，该途径不区分自身抗原和非自身抗原，即使是自身抗原，若形成50到100 Å的紧密多聚体形式，B细胞也可能会被激活产生ADA。
2、影响免疫原性的因素
虽然所有治疗性蛋白药物均有诱发免疫反应的潜能，但不同的治疗性蛋白药物其发生免疫反应的可能性不同。免疫原性的产生是由多因素共同作用的结果，如：患者背景（遗传、预存状态）、药物（结构、尺寸、序列以及杂质、制剂等）、治疗方式（给药方式、频次、持续时间等）因素均对免疫原性的形成有影响。美国药典通则1106对这些影响因素进行整理，主要可以分为3个方面。
2.1 患者相关因素
每个人的免疫状态都存在差别，而主要组织相容性和人类白细胞抗原（HLA）等位基因的差异与个体的免疫反应密切相关。如携带HLA-DRb-11, HLA-DQ-03, HLA-DQ-05等位基因的患者一般更容易产生免疫原性。患者免疫系统的激活状态也与免疫原性的发生有关。自身免疫性疾病患者的免疫系统处于激活状态，一般易于产生免疫原性，而肿瘤患者的免疫系统一般处于抑制状态，不易产生免疫原性。是否有相关药物接触史也影响着免疫原性的发生，如PEG在化妆美容类产品中广泛存在，患者可能经常接触含PEG的相关产品而存在针对PEG的预存抗体。
2.2 药物相关因素
治疗性蛋白被机体的免疫系统当做外源物，药物药效的发挥通常由其结构上表位序列的完整性决定，药物的氧化、脱酰胺、脱氨基、降解、构象等结构变化和序列差异都被认为是引起免疫原性的风险因素，因为它们能够改变蛋白的构象、加剧药物的聚集或者改变抗原摄取的动力学、加工和呈递抗原肽。上述药物的化学变化类似于生物转化，可能发生在受损的生理环境中，如炎症组织。重组内源性蛋白药物若发生结构的改变也会打破免疫耐受，导致ADA的产生。治疗性蛋白结构中的糖基化也会影响药物的免疫原性。治疗性蛋白的翻译后修饰由所选择产品的表达系统或者细胞系所决定。目前大部分在研产品或已上市产品均采用中国仓鼠卵巢细胞系（Chinese hamster ovary cell lines, CHO）。与其它如酵母、昆虫细胞系不同，采用哺乳动物细胞系获得的产品所具有的糖基结构被认为与天然的人糖基结构更为接近。保持与人相同的糖基化修饰对于重组人蛋白治疗药物尤为重要。糖基类型不但影响治疗性蛋白的功能，也会影响产品的稳定性、蛋白的折叠情况以及生物物理学特征的优化。所以，在生产过程中需要检测糖基化结构。但某些糖基化结构虽具有抗原性，但聚集性降低、且封闭免疫原性表位的情况也时有发生。聚体用来描述治疗性蛋白多聚物的形成，既可以在溶解在溶液中，也可以形成不溶性颗粒。治疗性蛋白最理想的情况是以其最小的天然均匀分散的形式存在。然而，它们通常会形成小到二聚体结构大到在显微镜下可见的颗粒。并且，从化学结构的修饰到环境因素如储存问题、浓度、pH、离子强度、冻融和机械锻炼等多种多样的因素都会影响治疗性蛋白的存在状态。尽管聚集具有较高的免疫原性风险，但是其与免疫系统的相互作用机制，以及它们的大小、数目、结构、数量的影响皆不明，有待于进一步研究。杂质是另一重要因素，具有佐剂特征。若存在于终产品中，即使在治疗性蛋白药物本身不产生经典的免疫原性情况下，杂质也可能会引起免疫原性。这些杂质可能来源于宿主细胞成份、色谱柱上的树脂、酶、内毒素、细菌DNA、以及用于纯化的单抗都可能残留在终产品中。它们能够激活模式识别受体（pattern recognition receptors, PRR），产生促炎性细胞因子，增加APC对抗原的加工和呈递。需要强调的是，由污染物所引起的非特异的免疫反应能够作为共刺激因素，打破免疫耐受，使机体产生ADA发生率增加，且增加滴度水平。但也有研究表明，在一些单抗产品中宿主细胞水平较高，却没有增加免疫原性的产生。由杂质产生的免疫反应一般为皮肤反应、过敏反应、以及血清学疾病等。随着哺乳动物细胞系的应用，以及纯化技术和其它下游工艺水平的提高，微生物相关的污染可以被控制到最低水平。这是药物研发的关键环节，比如宿主细胞蛋白就是生产不同阶段常规的监测指标。稳定剂的成分也尤为关键，典型的例子是Epogen制剂的蛋白稳定剂由人血清白蛋白变为PS80（聚山梨酯）后产生ADA，引起了严重纯红细胞再生障碍副作用。与容器的相互作用，或者与在灌封系统中遇到的各部分相互作用可能会产生蛋白结构的改变而产生免疫原性。与玻璃器皿或者空气相互作用可能会使蛋白发生变性，引起蛋白的聚集，可能产生免疫原性。所以，为了避免免疫原性的产生应选择不会致使蛋白药物聚集的材质作为容器。
2.3 治疗相关因素
给药途径可以影响免疫原性。由于皮下给药可能易被DCs摄取和加工，使其比静脉给药容易产生免疫原性；但有研究发现，16个非免疫调节剂皮下给药，ADA的发生率＜15%。粘膜给药和肺部给药途径也会产生免疫原性。通常高剂量药物产生的免疫原性低，但数据解读时应该注意，可能由于高剂量组在循环中存在高浓度药物干扰检测或者抗药抗体水平会随着免疫复合物的增加而降低所致。重复给药或间歇给药比一次性使用的单克隆抗体诱导免疫原性的可能性更高。之所以要关注免疫原性，是因为一旦治疗性蛋白发生了免疫反应，就有可能带来风险，轻则影响药物疗效，重则危及患者生命。在免疫原性无法避免的情况下，充分认识免疫原性可能产生的风险，及时进行监测产生免疫原性反应并及早进行干预就尤为重要。美国药典通则1106对产生免疫原性后可能的临床风险进行了汇总。
从临床表现来看，产生免疫原性后可能对患者无明显影响，可能影响药物的药代或药效，也可能带来额外的安全性问题。FDA在2016年总结并发表了其当时批准的121个生物制品，其中89%均发生免疫原性反应，其中有49%影响药效，60%有安全性相关问题。基于治疗性蛋白引起机体产生免疫反应后可能带来的有效性和安全性问题，有必要对治疗性蛋白的免疫原性进行评估与监测。免疫原性的评估可以从完全理论上的模拟计算，到临床前体内外实验预测，再到临床给药后直接监测受试者的免疫反应。计算机模拟计算主要基于T细胞表位预测来评价生物药物的免疫原性。各种T细胞表位预测的工具很多，FDA总结开发了TCPro预测工具，用于T细胞表位预测辅助进行免疫原性评估。
免疫原性体外实验主要通过检测免疫细胞激活释放的细胞因子来进行评价。MHC II抗原结合也是一种可选的体外免疫原性评价方法。最能反应药物免疫原性的方法是观察给药后免疫系统的反应。在进行人体给药之前，转基因动物和非人灵长类动物的免疫反应与人最为相似，是目前应该较多的免疫原性体内分析的模型。各种临床前免疫原性评价方法的优缺点汇总如下。
临床前各种预测免疫原性的方法虽然能够提供较多的信息，但与临床受试者真实免疫反应的相关性还没有形成业界共识，直接检测临床受试者血清中的抗药抗体仍然是目前公认的免疫原性评价方法，也是各国药监局的监管要求。目前FDA，USP，EMA，NMPA普遍推荐通过抗药抗体的检测来评价治疗性蛋白的免疫原性。而对抗药抗体检测也同其它定量检测有所差别，而是基于层级递进的分析策略综合评价抗药抗体的产生。目前业界公认的分析层级包括筛选-确证-鉴别三个层级，而在第三个分析层级-鉴别层级中，目前研究较多是滴度分析和中和抗体分析。筛选实验是整个层级分析的开始，应尽可能检测出全部的潜在阳性样本，可以允许存在一定的假阳性样本（一般为5%）。筛选实验的结果判断是基于统计的判定方式，使用药物未暴露人群的血清作为参考设置阳性样品判定的cut-off值，将高于cut-off值的样品判断为阳性。由于筛选实验天然有5%的假阳性样品，在筛选实验得到的阳性样品需进一步进行确证。确证实验一般采用同筛选实验相同的检测方法，在样品检测过程中加入一定量的药物竞争结合抗药抗体。如存在抗药抗体，则检测信号明显下降。为提高阳性样本的可信度，确证实验的假阳性率一般设置在1%。经过筛选和确证得到的阳性样本即为抗药抗体阳性样本，根据研究需要可对抗药抗体的浓度水平进行半定量检测-滴度实验。滴度实验与筛选实验使用相同的检测方法，以样品检测值高于cut-off值的最大稀释倍数作为样品的滴度。另外为了评估产生的抗药抗体是否影响药物的生物学活性，需要进行中和抗体检测。中和抗体的检测方法必须基于药物的作用机制进行设计。免疫原性研究主要聚焦在抗药抗体的检测和表征上，应获得抗药抗体的发生率、滴度、存续时间和中和能力数据。抗药抗体的检测可以使用多种生物分析平台来完成，包括ELISA（ Enzyme-linked immunosorbent assay）、ECL（Electrochemiluminescence）、RIA（Radioimmunoassay）、 SPR（Surface plasmon resonance）。此外，用于筛选和确认ADAs的免疫测定可以使用多种形式和检测系统进行，每种方法都有各自的优缺点。此外，人类ADA是复杂的分析物，它们通常是多克隆的，与不同区域结合，具有不同的同型和结合亲和力，因此对ADA分析方法的选择上要尽量针对其特异性的结合区域来选择，以充分评估药物的真实免疫原性。在分析平台的选择上，可以考虑下表中所列的各平台的分析方法的优缺点，规避可能出现的假阴性。
中和抗体检测一般基于药物的作用机制进行设计，USP1106对常见的药物作用机制进行了分类，并给出了推荐的方法选择，为了更全面的反应药物的作用机制，一般中和抗体检测选择基于细胞的分析方法平台。FDA在2018年统计了当时近五年的申报方法，其中ADA的检测以ECL和ELISA平台为主，中和抗体检测以细胞实验和竞争配体结合实验平台为主。
一种在研抗体类项目的临床实验入组了60例患者，每例患者共采集6个时间点（包括给药前）的血清样本用于抗药抗体检测。首先通过筛选实验，得出有6位患者的9份样本结果为阳性。通过进一步的确证实验确定其中3份为假阳性，另外3位患者的6份血清为ADA阳性。
注：-：筛选实验阴性；±：筛选实验阳性，确证实验阴性；+：筛选实验阳性，确证实验阳性。
通过titer实验来表征抗药抗体的相对含量，结果显示6份样品的滴度从160-1280不等。
图9 ADA阳性样品滴度分析结果
进一步研究产生的抗药抗体是否影响药物的药效，建立了活性抑制中和抗体检测实验， 6份ADA阳性样本均具有中和活性，能阻断药物的活性。免疫原性分析在治疗性蛋白药物的研究和开发中关注度越来越高，而临床试验中对于抗药抗体的检测更是成为了药监局的监管要求。免疫原性研究贯穿了整个药物研究的生命周期，且已经成为药监局和医药研究领域的共识。为了开发出更具竞争力的蛋白类药物，研究人员已经将免疫原性的研究前移，从药物设计阶段就通过各种技术降低药物的免疫原性，提高药物研究成功率。同时，开发和建立可靠的非临床免疫原性分析评估方法也对临床免疫原性提供早期的指导。相信随着临床抗药抗体分析为核心的免疫原性分析策略的进一步推广，以及对细胞免疫监测分析方法进一步完善，势必会更加全面、深入地推动药物研发进程。[1] FDA. immunogenicity testing of therapeutic protein products-developing and validating assays for anti-drug antibody detection.[2] NMPA. 药物免疫原性研究技术指导原则（征求意见稿）.[3] Ulitzka M., Carrara S. C. , Grzeschik J., et al. Engineering therapeutic antibodies for patient safety: tackling the immunogenicity problem[J]. Protein Engineering Design and Selection, 2020: 33.[4] Krishna M . Product-Related Factors and Immunogenicity of Biotherapeutics[J]. Journal of Pharmaceutical Innovation, 2019, 15(49):1-13.[5] Erik D. and Huub S.. Immunogenicity of Innovative and Biosimilar Monoclonal Antibodies[J]. Antibodies, 2019, 8: 21.[6] Schellekens H. and Jiskoot W.. Immunogenicity of Therapeutic Proteins[J]. Pharmaceutical biotechnology, 2013, 6: 133-141.[7] Davda J., Declerck P, Hu-Lieskovan S., et al. Immunogenicity of immunomodulatory, antibody-based, oncology therapeutics[J]. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2019 7:105.[8] Schreitmüller, Thomas, Barton B , Zharkov A , et al. Comparative immunogenicity assessment of biosimilars[J]. Future Oncology, 2018, 15.[9] Shankar G . Current challenges in assessing immunogenicity[J]. Bioanalysis, 2019, 11(17):1543-1546.[10] Osman N Yogurtcu, Zuben E Sauna, Joseph R McGill, et al. TCPro: an In Silico Risk Assessment Tool for Biotherapeutic Protein Immunogenicity[J]. The AAPS Journal, 21(5):96.
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