行研 | 双特异性抗体药物技术概览（上）

一

前言 

双特异性抗体（bispecific antibody，bsAb，以下简称双抗），是指可以与两个不同抗原或者与同一抗原的两个不同抗原表位相结合的一种分子。双抗的概念最早是在1960年由Nisonoff等人提出并发表在《Science》。1975年，杂交瘤技术的出现推动了双抗技术的发展。此后，Milstein等人在1983年通过杂交-杂交瘤（quadroma）技术制备了首个具有完整免疫球蛋白G（IgG）结构的双抗。2009年，首款双抗药物Catumaxomab（商品名Removab）上市，其作用是控制EpCAM阳性的恶性腹水，但仍然存在免疫原性、稳定性、溶解性、工艺性等问题。该药物于2017年由于商业原因退市。2014年，Amgen公司开发的Blinatumomab（商品名Blincyto，抗CD19×抗CD3）成为了第二款上市的双抗药物，用于治疗急性淋巴细胞白血病。第三款上市的双抗药物是由Roche公司在2017年推出的Emicizumab（商品名Hemlibra），用于存在VIII因子抑制物的A型血友病的成人和儿童患者的常规预防，以预防或减少出血的频率。

除了上述已获批的双抗药物外，在研的双抗项目数量已颇具规模。据统计，截至2020年6月，在全球范围内约有160多个双抗已进入临床试验阶段，同时还有270多个双抗处于临床前研究阶段。我们可以预期在未来数年将有更多的双抗药物陆续上市，进一步丰富对于疾病的治疗手段。

图1 | 促进治疗性双抗发展的概念创新和技术创新时间线

图片来源：Labrijn A. F., Nature Reviews Drug Discovery [J] 2019

二

双抗的新功能：1 1 > 2 

随着以PD-1/PD-L1为代表的单抗药物取得成功，生物大分子类新药已晋升为研发和投资的新贵，作为单抗药物的“升级版”，并且代表了抗体药物的前沿理念，双抗天生就自带光环，聚焦了大量的关注。据统计，截至2019年3月约有85个双抗项目处于临床阶段，至2019年9月项目数量已超过110个，而到2020年6月即已突破160个；并且处于临床前的新项目也在持续增加，这意味着未来一段时期内每年进入临床的双抗项目数量将保持快速增长趋势。面对如此迅猛的发展，我们不禁要问：双抗何故得此青睐？

 2.1 双抗vs单抗联合用药 

提起双抗，多数人可能首先就想知道双抗与两种单抗联合用药的区别。单抗联合用药是利用各单抗作用靶点在疾病调控过程中的相关性，通过协同作用来增强疗效或者减轻毒副作用，而双抗上本质也是对两个靶点起作用，因此在作用靶点的层面，两者有相似之处。如果双抗的活性或功能可以与通过将其亲本或参考抗体（parental antibody）联合用药的方式获得，这类双抗也被称为组合双抗（combinatorial bsAbs）。但另一方面，由于双抗的两种抗体结合域比例是固定的，就无法像联合用药一样通过改变不同抗体的给药比例来优化调整药物的毒性、药代动力学、药效动力学等方面性质。除此以外，双抗在分子设计、筛选优化、制备工艺等方面的技术难度与单抗相比更具有挑战性。可想而知，双抗的开发绝不仅是代替两种单抗联合用药，它具备了后者所无法实现的诸多新活性和功能，这些特性依赖于两种特异性的物理连接，这类双抗被称为专性双抗（obligate bsAbs），而由其介导的双重靶向概念被认为是专性概念。因此，双抗的真正价值是在其专性概念下所表现出的一系列特性，如桥接作用、增强抗肿瘤免疫反应、特异性激活免疫反应等。

 2.2 T细胞 - 肿瘤细胞桥接作用 

当前在研的双抗药物绝大多数是针对肿瘤治疗，在该领域的常用策略是通过双抗将效应T细胞导向肿瘤细胞进行特异性清除，即所谓的招募T细胞靶向于肿瘤细胞，从而获得优于单抗或单抗组合疗法的治疗效果。具备这项功能的双抗分子在设计上包含了T细胞结合域和肿瘤细胞结合域，可以分别与T细胞和肿瘤细胞结合，在两者间形成物理连接，使T细胞更好地发挥肿瘤杀伤作用（图2a）。此类双抗也被称为T细胞参与双抗（T cell-engaging bsAb，bsTCE）。第二款上市的双抗药物Blinatumomab即采用了这种设计，在非霍奇金淋巴瘤（NHL）和复发性/难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）的治疗中显示了出色的效果。目前有半数以上的在研双抗项目属于bsTCE。

图2 | 双抗作用机制示意图

图片来源：Labrijn A. F., Nature Reviews [J] 2019

 2.3 增强抗肿瘤免疫反应 

免疫应答过程中，T细胞的活化需要双信号刺激。第一信号来自T细胞受体（TCR）识别主要组织相容性复合体（MHC）/抗原肽复合物，传递抗原特异性识别信号；第二信号由抗原递呈细胞（APC）的共刺激分子提供，为非特异性共刺激信号，与T细胞相应受体相互作用产生，可增强TCR信号。第一信号决定T细胞活化的特异性，共刺激信号则决定T细胞的前进方向。大量实验证实，如果缺乏共刺激分子提供的共刺激信号，T细胞将进入无反应状态或免疫耐受，甚至引起细胞程序性死亡。

图3 | T淋巴细胞活化机理示意图

图片来源：Mader S., Inquiry into Life 8th edition [M] 1997

免疫检查点抑制作用是免疫系统对于维持自身耐受、防止自身免疫反应、以及通过控制免疫应答的时间和强度而使组织损伤最小化的一种机制。肿瘤细胞利用了这一点，通过使免疫检查点信号异常来削弱免疫反应进而形成免疫逃逸。

基于以上两种机制，双抗分子可以通过将T细胞结合域和肿瘤细胞结合域分别采用共刺激信号的激动剂和免疫检查点的拮抗剂，通过同时增强T细胞共刺激信号（即“踩油门”）和阻断T细胞反应抑制信号（即“松刹车”），达到在活化T细胞的同时抑制肿瘤细胞逃逸的双重效果，从而加强对肿瘤细胞的杀伤。Inhibrx公司在研的INBRX-105（PD-L1×4-1BB）就是这类双抗的代表，科望生物通过授权合作将其引进，正在国内开展临床试验。

 2.4 特异性激活免疫反应 

通过调整双抗分子的两个不同结合域与相应靶点的亲和力，可以特异性地激活免疫反应，以提高药物的安全性和耐受性。实现这项策略的途径又分为两种，一种作用于两个不同细胞的表面抗原，另一种则是作用于同一细胞表面的两种不同抗原。前者以PD-L1×4-1BB为例，双抗分子与肿瘤细胞PD-L1的亲和力远高于与T细胞4-1BB的亲和力，因此双抗会优先与肿瘤表面的PD-L1结合，在阻断免疫逃逸通路的同时实现4-1BB分子的聚集，为T细胞的激活提供了条件，从而有效降低了潜在的脱靶毒性，提高双抗的安全性。后者以CD47×CD19为例，由于多种肿瘤细胞通过高表达CD47释放“不要吃我”信号来避免被巨噬细胞吞噬，阻断CD47-SIPRα信号通路可以抑制肿瘤细胞的免疫逃逸；但CD47广泛分布于人体各种细胞中，特别在红细胞及血小板中具有较高的表达水平，因此，靶向CD47的抗体药物容易引发严重的溶血性贫血。CD47×CD19双抗分子被设计为靶向两种肿瘤抗原CD19和CD47，但与CD47的亲和力较低，而与CD19的亲和力较高，从而只对共表达两种抗原的肿瘤细胞起效，降低贫血等不良反应。在双抗研究中发现，作用于同一个细胞表面的两种靶点时，当与第一个靶点或受体结合后，会明显提高与第二个靶点结合的亲和力，这一特点被称为跨臂结合效率（cross-arm binding efficiency）。

 2.5 辅助因子结构类似物 

双抗分子可以通过模仿酶-底物结合的空间结构，起到类似于酶或辅助因子的作用。例如，双抗分子被设计成通过两个不同的结合臂将FIXa和FX聚拢，进而提高FIXa的催化活性，起到模仿FVIIIa（FVIII的活性形式）的作用来治疗血友病的效果（图2d）。Roche公司在此基础上开发出了Emicizumab，用于存在FVIII因子抑制物的A型血友病的常规预防。

 2.6 背负式运输（Piggyback approaches） 

上述的双抗功能都是依靠于双抗的两个不同的结合域与相应靶点同时结合，而另有一些双抗功能则是通过与两个不同靶点依次先后结合而实现的，具体表现为将双抗的第一种特异性单纯作为第二种特异性的运输方式，也被称为“绑架运输（hijacking approaches）”。这种策略可以使双抗能够进入到一些通常被限制的区域，如血脑屏障。在Alzheimer病的临床前动物研究中发现，含有转铁蛋白受体（TfR）结合域的双抗分子可以通过与TfR的结合，经转铁蛋白的转胞作用穿过血脑屏障，提高双抗另一个结合域的脑部转运。

三

双抗的新难点：2≠1 1

近年来，双抗药物的研究如火如荼，参与其中的药企和生物技术公司各施所长，开发出了林林总总数十种双抗技术平台。尽管从名义上双抗是将两个不同的单抗结构融合而形成的，但事实上双抗的研发要比单抗复杂得多，其中涉及到功能性、亲和力、效价（抗原结合位的数量）、抗原特性、抗体大小、Fc结构、链相关问题等多方面的问题，使得双抗的研发壁垒颇高。

 3.1 功能性 

任何一个双抗必定有其特定的功能性，双抗分子的设计是结合了具有不同特异性的抗体片段后形成的，但抗体片段经重新构造后，它们的功能性可能会与亲本抗体产生差异。在双抗的筛选中发现，单从亲本抗体的特征并不能预测出最有效力的双抗分子，因而实际上最终优化的双抗往往是基于经验在大量的抗体组合库中筛选而得的。

 3.2 亲和力 

抗原和抗体在特异性结合时会表现出不同程度的亲和力，但在构建双抗时，并非是亲和力越强越好。在对靶向T细胞抗原CD3的bsTCE研究中发现，低亲和力的CD3结合臂更利于bsTCE在肿瘤中的分布，并且避免了由CD3介导的血液快速清除和在脾、淋巴结等含T细胞的组织中富集。上文介绍的特异性激活免疫反应的功能也是基于双抗的两个不同结合域与各自靶点的亲和力差异而实现的。

 3.3 效价 

双抗效价的设计同样是影响其活性的关键因素。在bcTCE的研究中发现，通常仅用单价的CD3结合臂就能实现肿瘤依赖性的T细胞激活功能，并且可以避免由于CD3分子在T细胞表面交联而引起的抗原调变或细胞因子释放；然而，靶向肿瘤相关抗原（TAA）的抗体价数则需要根据该TAA的特性来决定。

 3.4 抗原特性 

双抗与目标抗原在形成大量接触点后才能实现其功能，因此，双抗的设计也需要与抗原特性相适应。相关研究发现，bsTCE的活性与抗原的表达水平呈现相关性，尽管这一观点还未成为被普遍接受的结论，但事实很可能是抗原表达水平在达到某个阈值后，bsTCE才能产生细胞毒性，并且不同抗原的阈值存在着差异。此外，诸如抗原的大小、肿瘤特异性、胞外端的大小和构象、抗原表位与细胞膜表面的距离、抗原所在细胞膜的流动性等因素都会影响bsTCE的功能实现。

 3.5 抗体大小 

相较于分子量大的双抗，分子量小的双抗更容易渗透进入肿瘤组织。在bsTCE作用的过程中，bsTCE需要将T细胞和靶向细胞拉到一个特定距离，形成免疫突触，继而产生T细胞介导的细胞毒性，因此，除了抗原表位与细胞膜表面距离的因素外，双抗的大小也同时影响着T细胞的激活。但另一方面，小尺寸的双抗与天然抗体相比更易于被肾脏清除，在体内的半衰期更短。因此，抗体大小需要根据所针对的适应症，在渗透能力、半衰期、免疫激活等方面平衡，选择合适的尺寸。

 3.6 Fc结构 

抗体的Fc片段（fragment crystallizable，可结晶片段）可与受体FcRn结合，减少抗体在细胞内的降解，延长抗体的半衰期，还可与免疫细胞上的受体结合，激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒性作用（CDC）及抗体依赖的细胞介导的吞噬作用（ADCP）。此外，Fc片段还能提高抗体的溶解性和稳定性。不过，含有Fc片断的双抗分子量通常较大，会降低对肿瘤组织的渗透，而且Fc片断也被认为具有免疫原性，会通过Fc与FcγR的结合激活T细胞，引起非肿瘤依赖的免疫反应。因此，在双抗的研发中，是否保留Fc片段或者对其进行工程化改造也是需要重点考虑的问题。

 3.7 链相关问题 

天然的抗体结构是由两条重链（H链）和两条轻链（L链）组成的，在单抗中，两条重链和两条轻链的氨基酸组成完全相同，组合后仅有一种结构。与单抗不同，最初的双抗开发策略则是通过共表达两条不同的重链和两条不同的轻链来实现的，这就导致了会产生16种可能的H2L2结构组合，将其中互为镜像的结构合并后，仍然有10种不同的抗体结构，而其中仅有1种是目标产物。因此，从10种可能的H2L2重组混合物中获得目标的功能性双抗成为了双抗开发的最初挑战之一，这通常称为链相关问题，也叫链错配问题。

其他的一些因素如溶解度、稳定性、半衰期、免疫原性等方面都是以上问题的外在表现，本文不再详细论述。

参考资料：

1、Labrijn A. F. et al. Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipepline. Nature Reviews Drug Discovery [J] 2019.

2、Zhang J. et al. Development of Bispecific Antibodies in China: Overview and Prospects. Antibody Therapeutics [J] 2020.

3、Nie S. et al. Biology drives the discovery of bispecific antibodies as innovative therapeutics. Antibody Therapeutics [J] 2020.

4、Wang Q. et al. Design and Production of Bispecific Antibodies. Antibodies [J] 2019.

5、Zhang J. et al. Development of Bispecific Antibodies in China: Overview and Prospects. Antibody Therapeutics [J] 2020.

6、太平洋证券，双特异性抗体行业深度报告：曙光初现的抗体V2.0，聚焦肿瘤领域。

7、叶金统等，双特异抗体的研究进展，生物工程学报[J]，2020。

8、生物制药小编，双特异性抗体。

9、宋社吾，双特异性抗体的研发难点梳理和前景展望。

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童浩萱博士 

智源信使  创始人

浙江大学本科，后于哈佛医学院拿到博士学位，其博士期间的导师为《我不是药神》中神药格列卫的发明者之——汤姆·罗伯茨教授。

攻读博士期间，童博参与了哈佛医学院附属肿瘤医院在脱氧核糖核酸、核糖核酸，人乳头瘤病毒及肿瘤疫苗的研发，以及诺华小分子药、抗体药、生物药在乳腺癌、肺癌、结肠癌和肝癌中的开发，临床试验设计等工作，积累了丰富的科研经验，成功推进多项临床试验和多项药品的上市。

博士毕业后，加入了美国波士顿知名的旗舰医药投资公司Flagship Pioneering，期间主要负责生物医药企业的孵化、项目开发、上市等运营工作。其间，童博士负责的成功上市案例包括NSDQ: MNRA、ALNY、SYRO、MCRB、SRTP等。