CHO细胞基因敲入构建技术原理

在CHO细胞中，可编辑的核酸酶的基因敲入主要通过NHEJ方法进行。Sakuma等人使用转录激活子样效应核酸酶(TALEN)和PITCh系统在CHO细胞中敲入一个大分子片段 （携带一个单链Fv-Fc（scFv-Fc），以及DsRed和嘌呤霉素耐药基因PuroR）^[5]。

为了估计CHO-K1 细胞中HPRT1位点基因敲入的能力和效率，首先使用 TALEN 介导的 PITCh 系统进行了整个质粒整合。DsRed和PuroR基因，分别由延伸因子 1 α (EF-1α) 和Simian病毒 40 (SV40) 启动子启动，独立放置在供体质粒中，以便于筛选质粒掺入的细胞（图 2）。然而，即使质粒通过随机整合整合到基因组中，这些基因也能发挥作用。所以在供体质粒中添加了修饰的 TALEN 靶序列，使MMEJ介导的PITCh能够实现。修改后的 TALEN 位点包含与基因组上原始目标位点不同的间隔序列，如图3 b所示。在每个靶点发生DSB后，理想情况下，9bp的Microhomologies可用于MMEJ介导的整合（图3b）^[5]。

图 3 荧光图像

图 4 敲入细胞克隆的 5' 和 3' 连接序列

CRISPR/Cas9技术可实现上述实验目标，此外，与传统技术（如TALEN）比起来，CRISPR/Cas9技术更简单高效！