大家好，今天要和大家分享的是2021年4月发表的一篇文章：“Systematic Assessment ofTranscriptomic Biomarkers for Immune Checkpoint Blockade Response in CancerImmunotherapy”。免疫检查点阻断（ICB）疗法在治疗某些癌症类型的少数患者方面取得了成功的临床反应。本项研究的目的是评估转录组生物标志物对肿瘤免疫反应的预测性能。首先，作者收集了22个转录组生物标志物，并构建了多个基准数据集，以评估在不同癌症中具有不同ICB药物的治疗前患者与它们的临床反应，预测性能和临床疗效之间的关联。结果发现“免疫检查点分子”生物标志物PD-L1，PD-L2，CTLA-4和IMPRES和“效应分子”生物标志物CYT与ICB反应和临床结果显着相关。这些免疫检查点生物标志物和另一种免疫效应物IFN-γ在黑色素瘤，尿路上皮癌和透明细胞肾细胞癌中表现出良好的预测能力。而且对于抗PD-1治疗和抗CTLA-4治疗，即使在相同的生物标志物类别中，表现最佳的反应生物标志物通常也是互斥的，并且在联合使用抗PD-1的患者中观察到大多数具有出色预测能力的生物标志物PD-1和抗CTLA-4治疗。
发表杂志：Cancers(Basel).
影响因子：6.129
一、研究背景
通过免疫检查点阻断（ICB）进行的癌症免疫疗法彻底改变了传统的肿瘤治疗方法，并为晚期黑色素瘤，鳞状和非鳞状非小细胞肺癌，肾癌，DNA错配修复，缺陷/微卫星不稳定性的高癌症，胃癌和肝细胞癌等带来了显着的临床疗效。然而，由于对免疫疗法存在内在抗性，只有少数患者对ICB有确切反应。在过去的十年中，已经开发了几十种生物标志物来预测对ICB的反应，PD-L1表达是最早和最有前途的生物标志物之一。越来越多的研究发现，肿瘤细胞和免疫细胞的PD-L1预治疗表达与改善反应率、无进展生存（PFS）和整体生存（OS）有关，可以有效地预测不同肿瘤类型的ICB临床结果。肿瘤突变负担（TMB）也成为ICB患者分层的一个有希望的生物标志物，仍然缺乏对这些转录ICB反应生物标志物预测效应的系统评估。
二、流程图
三、分析解读
1、数据收集和预处理
①收集TCGA数据库中16种癌症的基因表达特征。
②为了评估ICB反应预测，作者从其中10项研究中收集了ICB预治疗患者的基因表达和相应的临床数据，其中涉及四种主要的癌症类型（黑色素瘤，肾细胞癌，尿路上皮癌，非小细胞肺癌）和四种ICB治疗策略。
③收集来自四种癌症类型（GSE93157）的抗PD-1治疗样品的基因表达谱。
2、生物标志物收集和分数计算
①在PubMed和Google Scholar上广泛搜索有关转录组签名的研究，以区分可从ICI中受益的患者。
②对于每种生物标志物，其得分计算如下：
the expression of single checkpoint genes (PD-1, PD-L1, PD-L2
and CTLA-4)
average gene expression-based biomarkers (CYT, gene.CD8, IFN-gamma, Expanded immune signature, EMT and CRMA) were applied in a straightforward manner.
③通过CIBERSORT估计CD8 T细胞浸润的生物标记。
④使用TIDE 网站在每个数据集中进行ICB治疗响应预测。
⑤重建IMPRES和IS计算模型，并证明本研究所计算模型与使用相同数据集的原始文章高度一致。
⑥TIS，APM，C-ECM-p使用单样本基因集富集（ssGSEA）分析计算得出。
⑦IPRES使用基因集变异分析（GSVA）计算得出，均在GSVA R软件包中实现。
⑧Pan-F-TBRS基于主成分分析。
⑨将T细胞炎症的GEP评分计算为特征基因表达的加权和。
⑩使用MCP-counter算法从大量组织基因表达数据估计了肿瘤微环境（TME）中八个免疫细胞和两个基质细胞的丰度。
结果：
①作者选择了22种针对ICB反应的转录组生物标记，这些标记基于涉及免疫相关过程（如淋巴细胞浸润，抗原呈递，免疫抵抗和免疫逃逸）的单个基因或多个基因的表达（下图）。作者将这些生物标记物分为七个类别：（1）免疫检查点分子；（2）肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）；（3）与溶细胞活性和IFN-γ应答作用有关的“效应分子”；（4）抗原类别；（5）抗原提呈；（6）免疫抵抗；（7）涉及多重抗肿瘤免疫过程。
②转录生物标志物与ICB整体评价水平的反应相关。热图显示了任何两个生物标志物之间的相关系数，并根据TCGA泛癌系数的约6600个样本演示了各种生物标志物的分层聚类模式。正负相关分别为红色和蓝色表示（下图）。
③虽然这些生物标志物之间共享了一些常见的基因，但67.4%的生物标志物没有共享任何重叠的基因。热图显示了任何一对转录组生物标记之间重叠的基因数量。较深的红色表示更多重叠的基因。每个生物标记中的基因数目显示在括号中。
④在不同癌症类型的多个数据集中，生物标志物与对ICB的临床反应的相关性具有显著差异。左：双向Wilcoxon秩和检验p值，指示生物标记物在不同肿瘤中是否显着区分反应者与非反应者（NR）（使用“PD”策略进行分层的患者），红色虚线表示0.05 p值的阈值。点的颜色代表每个数据集的ICB处理类型。品红色表示抗PD-1，黄色表示抗CTLA-4，浅绿色表示“在先前的抗CTLA-4上进展后的抗PD-1”，蓝色表示组合的抗PD-1和抗CTLA-4免疫疗法中，草绿色代表多种ICB治疗，紫色代表抗PD-L1。右：箱形图，显示了在反应性（R）肿瘤与非反应性（NR）肿瘤之间具有显着差异的生物标志物实例（Wilcoxon秩和检验p<0.05）。方框中的黑线表示较高的75％，中值和较低的25％值。
3、基于临床反应的患者分类
在作者的分析中考虑了四种根据RECIST或irRECIST标准定义反应者和非反应者的常用策略：①PD（进行性疾病）策略：将完全或部分反应或稳定疾病的患者定义为“反应者”。②OR（客观响应）策略：“响应者”是根据RECIST标准使用完全响应或部分响应的复合终点定义的。③OS（长期总体生存应答）策略：“应答者”定义为根据RECIST标准使用完全或部分应答的复合终点或总生存期大于一年的稳定疾病。④DCB（持久临床获益）策略：“反应者”是指根据RECIST标准使用完全或部分反应的复合终点或无进展生存期超过六个月的稳定疾病定义的“反应者”。在患者中不同癌症类型的总体客观反应率为28.4%。黑色素瘤、ccRCC、UC和NSCLC的客观反应率分别为35.2%、24.2%、23.6%和25.7%。黑色素瘤患者对抗PD-1治疗的客观应答率（42.2%）和抗PD-1和抗CTLA-4组合疗法（65.6%）较高（下图）。
4、生物标志物预测性能评价
①根据“PD”策略计算AUC，以评估生物标志物对临床反应的预测能力。
②使用pROC软件包构建接收器工作特性（ROC）曲线。
③计算了样本大小加权的AUC（标记为预测得分），以比较不同的生物标记物。
生物标志物的预测得分定义如下：
结果：
①在所有生物标志物中，IS、Mutation_load和CRMMA的中位敏感性和中位特异性一直很高。IMPRES显示对响应的中位数敏感度最高，但中位数特异性非常低。相比之下，IPS和TIDE的灵敏度最低，但其特异性相对较高（下图）。（A）在10个基准数据集中的响应分类策略“PD”下，每个生物标记物的AUC值分布，方框中的黑线表示较高的75％，中位数的和较低的25％的生物标志物。（B）在10个基准数据集中，每个生物标记物的敏感性和特异性，以中位数作为阈值进行计算，以进行二元预测。
②在整体评估水平上，每种生物标志物对ICB反应的预测性能。ROC曲线量化了10个基准数据集中不同生物标志物的预测准确性。
③在整体评估水平上，每种生物标志物对ICB反应的预测性能。显示了10个基准数据集的AUC以及不同生物标记的预测得分（样本大小加权AUC的总和）。
④不同癌症类型和不同ICB治疗策略的ICB反应生物标志物的预测性能。A-D条形中心由不同癌症数据集中每个转录生物标志物的平均AUC值定义。E-H条中心由黑色素瘤数据集中每个转录生物标志物的平均AUC值定义，根据不同的ICB治疗策略。
5、生存分析
①Kaplan-Meier分析以评估高分（>中位数）和低分（<中位数）患者之间生物标志物得分与总生存（OS）和无进展生存期（PFS）的关联。②评估TME组件与不同癌症类型和疗法对ICB的临床反应之间的关联。①ICB反应生物标志物对ICB治疗的临床疗效的影响。下图A：Kaplan–Meier生存曲线显示了黑色素瘤中T cell-inflamed GEP score和ccRCC PD-L2得分高或低的患者的OS或PFS。下图B：Kaplan-Meier生存曲线显示了在抗PD-1治疗下PD-L1高分和低分，在抗CTLA-4治疗下扩展的免疫特征和在“抗CTLA-4程序抗”下的IPS的患者的OS-PD-1”疗法。下图C：左侧饼图显示了每个总体基准数据集中每种反应生物标记物的关联重要性，右侧的条形图显示了每个数据集中的患者人数。饼状图的左半部分表示相应生物标志物得分较高的患者，红色和深灰色分别表示高分患者中有反应者和无反应者的比例。饼状图的右半部分表示相应生物标记物得分较低的患者，蓝色和浅灰色分别表示低得分患者中有反应者和无反应者的比例。无颜色的边框，灰色边框和黑色边框分别表示p≥0.1、0.05≤p<0.1，p<0.05。不同类别的生物标志物用不同的颜色表示。
②不同的TME组件也显示了与ICB反应在不同的癌症组别遵循各种ICB治疗策略的不同相关性。其中，CD8 T细胞和T细胞与黑色素瘤、ccRCC和UC对ICB免疫疗法的反应呈最显著的正相关关系。下图A：显示TME组件的丰度与ICB反应的相关性，在特定癌症类型中与不同的ICB治疗相关。下图B：预测每个TME组件在不同癌症和治疗类型中对ICB响应的预测性能。
小结：
在本研究中，作者针对不同评估情况构建了多个ICB治疗基准数据集，系统评估了当前22种转录组生物标记物对ICB反应的预测能力，这些标记物涉及免疫检查点，淋巴细胞浸润，免疫抵抗，免疫逃逸等机制。结果表明，生物标志物PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4和IMPRES的“免疫检查点分子”和CYT的“效应分子”显示出与ICB反应最稳定的相关性和出色的预测性能。同时，在大多数数据集中，一些生物标志物显示出与ICB响应稳定关联的趋势，但是生物标志物显示数据集的预测性能存在巨大差异。本研究结果提供了转录组生物标志物对ICB反应的系统评价，为患者分层的潜在策略提供了新颖的见解，并有助于提高ICB免疫疗法的预测准确性。潜在局限性是在于缺乏大型患者群体，无法进行更充分的评估。
