卵巢早衰动物模型的构建技术原理
李芳媛 综述 薛 晴 审校
北京大学第一医院（100034）
卵巢早衰（POF）是指女性40岁以前由于卵巢内卵泡耗竭或医源性损伤导致卵巢储备功能衰竭，由于未能获得足够量的初始卵泡、或原始卵泡发育障碍、过度清除和激活抑制等原因所造成的卵子耗尽通常是本病的病理基础［1］。该病主要特点是闭经伴随血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，在诊断为POF之前，患者通常表现为月经周期的不规则和不孕。POF是一种临床高度异质且病因混杂的疾病，约超过半数的患者临床上找不到明确的病因。目前已发现的部分相关病因包括遗传因素、医源性因素、自身免疫性因素和环境因素，其中以遗传因素为主。为了进一步研究疾病的发生发展机制，科学地构建病理生理学特征与实际临床症状相符，且建模成功率高的动物疾病模型显得尤为重要。本文拟对不同病因的POF动物建模方式的研究进展进行综述。
1 遗传因素
现有许多基因突变的小鼠模型用以研究人卵泡发育。这些模型不仅揭示了人POF可能的发生发展机制，也便于挑选特定的候选分子作为潜在的药物靶点。
1.1 卵母细胞减数分裂相关
减数分裂解旋酶1(Hfm1）基因编码一种染色体同源重组所必需的蛋白，包含DNA / RNA解旋酶中保守的基序，仅在卵巢和睾丸中表达，在维持卵巢和睾丸的正常功能中起着重要作用。Guiraldelli等［2］构建了用于破坏Hfm1的基因捕获载体，包含病毒长末端重复序列（LTR），伴随剪接受体序列（SA）和带有多腺苷酸化信号（pA）的无启动子的选择性标记新霉素（Neo）。该载体还包含磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子，其后是剪接供体（SD）上游的Bruton酪氨酸激酶（Btk）基因的第一个外显子。最终构建出不表达HFM1蛋白的Hfm1缺陷小鼠。该雌鼠的原始生殖细胞发育障碍，卵巢体积明显减小，基质细胞增加，卵泡和黄体数量减少，因此，研究者发现Hfm1基因在染色体配对和重组过程中发挥重要作用。Wang等［3］通过将Hfm1fl/fl小鼠与携带Gdf-9启动子介导的Cre重组酶的转基因小鼠杂交，构建了Hfm1fl/fl；Gdf9-Cre卵巢条件性敲除小鼠模型，发现Hfm1基因参与小鼠卵母细胞减数分裂过程中高尔基体相关纺锤体的组装和分裂。这些动物模型的构建，为POF发病机制中卵母细胞减数分裂异常提供了线索。
1.2 原始卵泡激活相关
1.2.1 Pdk1 磷酸肌醇依赖性激酶l(PDK1)在调节磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）与丝氨酸/苏氨酸激酶之间的细胞信号传递中起着至关重要的作用［4］。小鼠卵母细胞中PDK1的缺失会使原始卵泡寿命受损导致卵巢加速衰老和POF，同时卵母细胞中PDK1/蛋白激酶B(PKB )/核糖体蛋白S6激酶β1(S6K1）/核糖体蛋白S6（rpS6)信号通路的抑制也会导致POF［5］。Gao等［6］采用条件性敲除Pdk1的方法，将Pdk1fl/fl小鼠与携带Gdf-9启动子介导的Cre重组酶的转基因小鼠杂交，构建出Pdk1fl/fl；Gdf9-Cre POF小鼠模型。该小鼠与野生型小鼠相比，后代数目明显降低，卵泡刺激素（FSH)和黄体生成激素(LH)水平升高，卵巢中大量的原始卵泡被激活,提示卵巢功能受损。
1.2.2 FoxO3a FoxO3a基因位于6q21，FOXO3a蛋白能够参与多种发育过程和信号传导通路，如与Smad家族成员结合而在TGF-β信号传导中起作用等。在哺乳动物中，FoxO3a基因能在细胞周期的G2-M检查点起作用，并触发受损DNA的修复［7］，在保护细胞免受氧化应激［8］等过程中发挥重要作用。但是在卵巢中，研究者发现FoxO3a的高表达影响卵泡旁分泌和缝隙连接，抑制卵母细胞生长［9］。在FoxO3a的基因敲除雌鼠中，小鼠表现出更早的整体性卵泡活化，从而导致卵母细胞过早死亡，发生功能性卵泡的早期耗竭和继发性不孕［10］。同样，通过FoxO3小干扰RNA敲低猪卵巢组织中的FoxO3，将其异体移植到裸鼠肾囊后，也得出了FoxO3基因敲除过早激活了原始卵泡发育的相似结论［11］。随后，在FoxO3a基因敲入小鼠模型中发现，新生鼠原始卵泡发育延迟，原始卵泡池增加;成年鼠则表现为卵巢储备增加及生育能力增强［12］。
1.3 卵泡丢失相关
RICTOR蛋白是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体2（mTORC2）的基础组成成分，该复合体参与调控胚胎发育、细胞骨架重组与细胞迁移、及蛋白质合成等过程。但目前对Rictor基因在卵巢中发挥的作用的研究甚少。有研究者通过下述方法构建卵巢条件性敲除Rictor的小鼠模型，即通过雄性Zp3-Cre小鼠与雌性纯合子Rictorfl/fl小鼠交配，产生雄性杂合子，后代继续与雌性纯合子交配，获得卵母细胞特异性缺失Rictor(Rictorfl/fl; Zp3-Cre)的条件性敲除Rictor雌性纯合子小鼠。该模型中，促凋亡蛋白表达增多，健康的卵泡和黄体数目明显减少，大量成熟的卵泡丢失闭锁［13］。
通过建立转基因动物模型，有助于研究某些特定基因在POF发病机制中所起的作用，便于疾病预测、检测和基因治疗靶点选择。然而，由于疾病发病机制多样，影响因素混杂，在遗传因素方面也常常非单一致病基因引起，直接导致定位某特定基因的困难度增加。此外，尽管基因敲除技术日臻完善，但技术实施要求高，动物模型的建立需要的成本相对较高。POF模型也因其生育力降低，常常无法将致病基因传递给下一代，给基因家系等遗传学方面的研究带来困难。
2 自身免疫因素
自身免疫性卵巢疾病(AOD)是一种由患者卵巢组织为抗原引起的罕见的自身免疫性疾病,为早期绝经综合征的病因之一，属于慢性炎症性疾病［14］，约20%~30%的POF与自身免疫性疾病相关。构建自身免疫性卵巢炎的动物模型大致可以分为以下3种。
2.1 透明带抗原3（ZP3）
ZP3作为透明带蛋白家族的重要成员，是精子的受体蛋白，促发精卵结合和顶体反应。不少研究用ZP3诱导卵巢免疫性炎症，以建立自身免疫性POF模型［15-25］。具体步骤为将ZP3多肽溶解在双蒸馏水中，终浓度为1mM，超滤灭菌。在不完全弗氏佐剂中乳化后，注射在小鼠前后足垫或者尾根部［15-16］。与手术组相比，用ZP3诱导卵巢免疫性炎症的小鼠表现出不规则的发情周期，包括发情周期延长和缺乏发情，且卵巢皮质中典型的成熟卵泡较少。该模型较为成熟，操作简单，在免疫性POF的相关研究中应用广泛。
2.2 胸腺切除
这种方法通过将出生3d的小鼠的胸腺切除（D3tx）建立AOD小鼠模型。其成年后90%表现为体内抗卵巢抗体阳性，促性腺激素升高，雌激素降低，卵巢组织淋巴细胞浸润，卵巢萎缩，结构破坏，发育不良［26］。该模型的产生有重要的意义，即通过干扰正常个体的免疫调节，制造自身免疫性疾病模型，研究者通过对D3tx小鼠的研究，加上对裸鼠自身免疫性疾病的研究，共同推动了CD4+ CD25+ T细胞的发现［17］。但需要注意的是在切除胸腺后，往往也会引起其他腺体的免疫功能紊乱，不利于卵巢单一因素的研究。
2.3 卵巢抗原主动免疫
为了尽可能避免胸腺切除引起多腺体自身免疫病，有学者提出用小鼠自体卵巢作为特异性抗原，通过主动免疫，产生单纯的免疫性卵巢炎。取BALB/c小鼠卵巢组织,用Tris-Hcl缓冲液研磨成匀浆, 超声破碎离心取上清液，加入等量不完全福氏佐剂和卡介苗碾磨乳化后,在同种小鼠腹部或足底多点皮下注射,同时小鼠尾静脉注射百日咳疫苗。每3周加强免疫1次。该模型小鼠动情周期紊乱，生育力低下，卵巢中卵泡数目减少，卵母细胞和透明带形态异常，病理损伤明显［24-25］。该模型用自体卵巢作为特异性抗原，使动物产生单纯主动的免疫性卵巢炎,避免了多腺体疾病的交叉影响,有利于卵巢单一因素的研究。
3 医源性因素
不论是卵巢良性肿瘤（卵巢囊肿、成熟性畸胎瘤等）或其他盆腔部位的手术治疗，恶性肿瘤术后的放化疗，还是有生殖毒性的药物应用，都可能引起POF的发生。
3.1 化疗
化疗药物容易引起肿瘤患者卵巢及生殖细胞结构功能的损害，针对下述常见的化疗药物，许多动物模型应运而生，逐步优化。
3.1.1 顺铂 铂类药物对卵母细胞和颗粒细胞都有毒性作用，可以消耗卵巢储备，影响卵泡发育和成熟［27］。董若曦等［28］研究了顺铂腹腔注射构建大鼠POF模型的最优剂量，通过不同剂量组间比较得出，腹腔大剂量注射顺铂4 mg/kg，间隔1周再次注射4 mg/kg，不仅使Wistar大鼠动情周期紊乱，质量明显下降，还能使血清抗苗勒氏管激素（AMH） 水平和各级卵泡数量降低的更明显。
3.1.2 环磷酰胺 作为常用的细胞周期非特异性化疗药物之一，通过DNA烷基化导致颗粒细胞和卵母细胞DNA断裂，影响DNA合成，损害卵巢正常功能［29］。有研究者为寻找POF家兔最佳建模方式，比较了环磷酰胺不同给药方式下的家兔卵泡的状态，得出50 mg/kg 剂量连续注射2d效果最佳，原始卵泡、初级卵泡的异常率和颗粒细胞的凋亡率明显升高，同时动物死亡率最低的结论［30］。另外，有学者通过比较得出，给大鼠一次性腹腔内注射环磷酰胺120 mg/kg，联用皮内注射白消安12 mg/kg的POF造模方法，时间短、成功率高且死亡率低，简便易行［31］。
3.1.3 表柔比星 因其广谱性，毒性低，被广泛用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等的治疗，但由于其严重的副作用，如肾毒性、肝毒性、心脏毒性，生殖毒性等［32-36］， 也被用于POF动物模型的构建。Wang等［37］对雌性ICR小鼠腹腔注射表柔比星，3 mg/kg，连续注射20d，构建出雌激素和孕激素降低，初级卵泡、次级卵泡和总卵泡数目降低，而卵巢凋亡水平和ROS水平增加的POF小鼠模型。
化疗药物建模的方法简单易行，模型性状稳定，应用广泛。但是化疗药物对动物全身各系统的影响较大，存在一定的缺陷。例如，顺铂影响神经系统，不利于对卵巢早衰动物脑部功能的后续研究；环磷酰胺有时会诱发严重的骨髓抑制、感染、出血性膀胱炎，若注射剂量、时间把握不佳，易在建模过程中使动物因副作用而死亡；同样，表柔比星的心脏、肝肾毒性也是造成模型动物死亡的潜在因素。
3.2 放疗
卵巢对射线十分敏感，其中原始卵泡受损最明显［38］。真核细胞暴露在电离辐射下会立即形成持续数毫秒的自由基，引起氧化损伤。活性氧的增加导致卵巢中原始卵泡的迅速丢失［39-40］。常用于建模的射线有以下几种。
3.2.1 X射线 Gao等［41］用CLINAC 2300C/D-SN27X射线仪在100C Gy/min强度下对昆明鼠进行4 Gy 单剂量X射线照射，得到的POF小鼠表现为原始卵泡、窦前卵泡数目降低，闭锁卵泡数目增加；颗粒细胞增殖降低。Tan等［42］利用Rad source生物X射线照射仪，以4Gy单剂量和1.2 Gy/min的强度，对C57BL/6J 小鼠进行全身X射线照射， 照射结束2~7d后，小鼠表现为发情周期紊乱，卵巢重量、血清AMH、原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡计数等均下降。
3.2.2 γ射线 孙萍等［43］探究了不同剂量的钴60γ射线对卵巢功能的影响，分别用0.5 Gy和0.7 Gy 钴60γ射线照射大鼠后发现，随着射线剂量的增加，闭锁卵泡数目逐渐增多，成熟卵泡和次级卵泡数目逐渐减少，颗粒细胞层变薄，而大剂量的射线加重了卵巢早衰的程度。射线造模操作方法简单，耗时短，效果显著，因而易于推广。但是，射线造模可对动物全身系统造成不同程度的影响，辐射剂量和时长的选择对模型动物的存活和建模的成功至关重要。同时，放射的方法对仪器设备的要求高，也对实验者的健康产生潜在危害，实验人员的安全防护不可忽视。
3.3 生殖毒性药物
雷公藤制剂具有免疫调节、抗肿瘤、改善微循环、抗炎、解热镇痛等作用，在临床上被广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等风湿免疫性疾病。近些年，随着对该药物的深入研究，其严重的生殖毒性越来越受到关注，在实验中常用于POF造模。有研究者按 50 mg/kg给予Balb/c 小鼠雷公藤多苷片溶液灌胃，1 次/d，连续 14d［44］。造模期间，小鼠动情周期紊乱；FSH、黄体生成激素 （LH）水平升高，雌二醇（E2）降低；卵巢组织萎缩，结构紊乱，表现为各级卵泡数量减少，闭锁卵泡增多，卵母细胞及透明带形态异常，黄体数量减少且形态不规则。小鼠激素水平以及卵巢结构至停止造模35d后尚未恢复正常。另外，也有研究者通过连续14d每天给予SD大鼠雷公藤多苷片制剂75 mg/kg灌胃，构建出表现相似的大鼠POF模型［45-46］，提示该模型的构建较为稳定。
4 代谢因素
近年来研究发现，半乳糖血症和POF有关。半乳糖血症为血半乳糖增高的中毒性代谢综合征，半乳糖代谢3种相关酶中的任何一种若存在先天性缺陷均可致半乳糖血症。研究者通过给小鼠颈背部皮下注射 D-半乳糖 200 mg/（kg·d），连续给药42d，构建出动情周期紊乱，卵巢 SA-β-半乳糖苷酶染色阳性率显著升高的POF模型［47］。此外，通过给大鼠或小鼠饲喂35%半乳糖食物颗粒持续70~80d构建POF模型的方法也相对成熟［48-50］，动物可出现动情周期紊乱，子宫内膜变薄，E2降低，发育中的卵泡数和黄体数减低等卵巢功能下降的表现，同时该模型也存在构建时间较长等问题。
POF发病率日趋增加，40岁以下的发生率为1%，30岁以下的发生率为1‰，影响女性生育力的保存。POF是一种病因复杂的疾病，在体研究的局限性推动了动物模型的发展。为了深入研究疾病的发生发展机制，探究治疗方法，建立操作易行且性状稳定的动物模型具有重要的意义。从现有的不同发病机制出发，常用的建模方法有敲除相应基因靶点、损伤免疫或代谢功能、利用化疗药物或放射线照射等。可就重复性、耗时长短、成功率高低等因素综合考虑，通过化疗药物建模相对成熟可靠。然而，现有方法大多只能模拟单一致病因素，不能完全满足实验需求，且尚未对成熟模型有统一的量化标准。尽管动物模型因其局限性不能完全模拟人类疾病，但不断发展优化的动物模型为疾病发病机制和治疗靶点的探索提供了更多可能。