Theranostics：欧易助力武汉协和医院发现前列腺癌抑制分子机制
前言
2020 年 11 月，华中科技大学同济医学院附属协和医院谌科、杨雄、章小平教授为通讯作者，在 Theranostics (IF: 8.579) 发表了题为“ACSS3 represses prostate cancer progression through downregulating lipid droplet-associated protein PLIN3”的研究论文，报道了前列腺癌中 ACSS3 通过下调脂滴相关蛋白 PLIN3 抑制肿瘤进展的分子机理。
华中科技大学同济医学院附属协和医院周利杰博士、附属武汉中心医院宋正帅博士为共同第一作者。文章中代谢组、转录组测序和分析由欧易生物协助完成。
研究背景
目前前列腺癌（PCa）的内分泌治疗主要抑制雄激素/雄激素受体（AR）信号传导。然而由于瘤内雄激素合成和雄激素受体变异增加，前列腺癌发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC），最终对内分泌治疗产生抗性。临床应用上迫切需要寻找新的治疗角度。
研究表明 PCa 细胞中的脂质积累与 CRPC 和恩扎卢胺或阿比特龙耐药性的发展密切相关。雄激素受体信号传导介导的 PCa 细胞脂质积聚增加了肿瘤内雄激素的合成，从而促进了雄激素受体的再激活和异常激活，导致 CRPC 进展。减少 PCa 中脂质积累的有效方法尚不清楚。
研究内容
通过筛选前列腺癌数据库中的脂代谢相关基因集和生物信息学分析，确定了前列腺癌中脂代谢相关的关键基因。研究发现酰基辅酶a合成酶短链家族成员 3 (ACSS3) 下调，预示着 PCa 预后不良。ACSS3 表达的丧失是由于基因启动子甲基化。PCa 细胞中 ACSS3 表达的恢复显著减少了 LD 沉积，从而通过增加内质网应激促进凋亡，并减少雄激素合成，抑制 CRPC 进展和逆转恩扎卢胺抗性。机理研究表明，ACSS3 通过调节 LD 外壳蛋白磷脂 3 (PLIN3) 的稳定性来减少 LD 沉积。
研究结果
1. 前列腺癌中 ACSS3 表达下调预示预后不良
通过对 TCGA 等 5 个前列腺癌数据库进行数据分析，共筛选获得 4 个与脂质代谢相关的基因，K-M 分析显示其中的 ACSS3 与前列腺癌预后具有显著相关性（图 B），ACSS3 低表达与肿瘤分期、转移、复发和格里森评分呈正相关。免疫组化实验也显示 PCa 组织中 ACSS3 蛋白水平显著低于正常组织（图 D）。
ACSS3 在前列腺癌中低表达并预示不良预后
基于 CCLE 数据库中前列腺癌样品分析，并通过 BSP 实验证实，ACSS3 的启动子区域发生了甲基化富集。利用甲基化抑制剂 5-aza-dC 处理前列腺癌细胞系，结果显示 ACSS3 启动子区域甲基化水平降低，而 ACSS3 的 mRNA 和蛋白质表达水平升高。以上结果表明高甲基化在 ACSS3 的表达沉默中起着至关重要的作用。
2. ACSS3 可以抑制异常脂质积聚和肿瘤细胞生长
利用 TCGA 中 PCa 数据进行基因富集分析（GSEA），结果显示，抑制前列腺癌和转移有关的信号通路、脂质代谢过程有关的信号通路与高 ACSS3 表达高度相关。
在前列腺癌细胞中过表达 ACSS3，可以显著降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力；而 ACSS3 敲除对细胞影响相反。细胞中脂质的异常积累通常以脂滴（LD）的形式出现。油红 O 染色显示，过表达 ACSS3 的 PCa 细胞中 LD 沉积显著增加。LC-MS 脂质组学分析显示，与对照细胞相比，过表达 ACSS3 的细胞中甘油三酯、磷脂酰肌醇等 LD 的重要组分的含量均发生显著下降。
图片说明：A) GSEA 富集分析结果；B) -C) 油红 O 染色观察 ACSS3 过表达或敲除对细胞的影响；D) LC-MS 代谢组 Heatmap 结果图
3. ACSS3 促进内质网应激介导的细胞凋亡
转录组测序显示，与对照相比，前列腺癌细胞 C4-2 中过表达 ACSS3，导致内质网应激相关通路和 marker 基因显著上调，调钙通道相关信号通路和marker 基因显著下调，并通过 qRT-PCR 和 WB 实验进行了证实。内质网追踪成像分析表明，在 ACSS3 过表达的细胞中内质网扩张，并且透射电镜进行的超微结构分析证实了扩张的和不规则形状的粗糙内质网的存在，这两者都与内质网应激一致。由于内质网应激通常激活凋亡信号通路，TUNEL 分析显示 ACSS3 的过度表达与凋亡细胞百分比的增加有关。综上表明 ACSS3 促进了内质网应激介导的细胞凋亡。
图片说明：A) ACSS3 过表达细胞转录组测序的 Heatmap 和 GO 富集结果；B) GSEA 分析结果；C) D) qRT-PCR 和 WB 对转录组测序结果进行验证；E) 内质网追踪成像分析；F) 透射电镜观察内质网超微结构
4. ACSS3 调节 PLIN3 的蛋白稳定性
PLINs 蛋白家族是主要的 LD 相关蛋白。WB 显示过表达 ACSS3 导致 PLIN3 蛋白表达水平下降，而 RT-PCR 显示 PLIN3 mRNA 水平上改变不显著。PLIN3 mRNA 与蛋白质表达水平的不一致暗示 ACSS3 可能通过影响 PLIN3 蛋白质的稳定性来调控 PLIN3 的水平。
利用放线菌酮抑制蛋白质的合成，结果显示过表达 ACSS3 的细胞中 PLIN3 的半衰期显著缩短（下图 C）；添加蛋白酶体抑制剂 MG132 和溶酶体抑制剂氯喹，可以抑制由 ACSS3 诱导的 PLIN3 的降低（下图 D）；同时 IP 实验显示 ACSS3 过表达的细胞中 PLIN3 的泛素化水平显著升高（下图 E）。以上结果表明，ACSS3 可能通过促进泛素/蛋白酶体途径介导的蛋白质降解来抑制 PLIN3 蛋白的稳定性。
已有的研究报道显示 AIP4 E3 泛素连接酶可以调节脂滴内 PLIN2 等脂质相关蛋白的泛素化水平。过表达 ACSS3 可以显著增加 pull down 的 AIP4 蛋白的含量，表明 ACSS3 可能通过招募 AIP4 E3 泛素连接酶到脂滴中以调节 PLIN3 的泛素化水平。
图片说明：A) B) RT-PCR、WB 检测 PLINs mRNA 和蛋白质表达水平；C) D) 分别利用放线菌酮、蛋白酶体抑制剂 MG132 和溶酶体抑制剂氯喹处理 ACSS3 过表达的细胞后，检测 PLIN3 的蛋白表达量；E) F) IP 实验检测蛋白泛素化水平
5. PLIN3 是 ACSS3 介导的肿瘤抑制所必须的
在 PCa 细胞中单独过表达 PLIN3，或同时过表达 ACSS3 和 PLIN3，均能显著提高细胞的增殖、迁移、脂滴大小、胆固醇含量等指标，并且两者之间没有明显差异。过表达 ACSS3 的同时敲除 PLIN3，细胞出现肿瘤抑制表型。体内实验证实，过表达 ACSS3 和/或敲除 PLIN3 可以抑制肿瘤的生长和转移。综上表明，ACSS3 可以通过 PLIN3 依赖性信号传导而介导肿瘤的抑制。
图片说明：PLIN3 可以挽救 ACSS3 介导的肿瘤抑制表型
6. ACSS3 抑制 CRPC 进程并逆转恩扎卢胺抗性
胆固醇是雄激素合成的前体，以胆固醇酯的形式储存在 LDs 中。用胆固醇处理过表达 ACSS3 的细胞，结果显示 ACSS3 过表达抑制了细胞的增殖，而胆固醇治疗缓解了 ACSS3 的抑制效果（下图 A）。并且在 CRPC 细胞 C4-2 中过表达 ACSS3，可以使 C4-2 细胞恢复对胆固醇治疗的敏感性（下图 B）。
研究报道棕榈酸可以导致细胞中脂质累积的剂量依赖性增加。实验结果显示，棕榈酸可以挽救 ACSS3 过表达所引起的肿瘤抑制作用。LC-MS 检测显示过表达 ACSS3 和/或敲除 PLIN3细胞中睾酮和二氢睾酮含量显著降低（下图 C）。这表明 ACSS3 通过 PLIN3 依赖性信号传导抑制肿瘤内雄激素的合成。
与 C4-2 细胞相比，恩扎卢胺抗性细胞 C4-2-ENZR 中 ACSS3 表达水平降低、PLIN3 表达水平升高。在 C4-2-ENZR 中过表达 ACSS3 后，使得 C4-2-ENZR 细胞恢复了对恩扎卢胺的治疗敏感性，这表明 ACSS3 逆转了恩扎卢胺抗性。体内实验同样证实，ACSS3 可以抑制 CRPC 进展，并恢复恩扎卢胺的治疗敏感性。
图片说明：ACSS3 抑制 CRPC 进展并可以逆转恩扎卢胺抗性
为进一步研究 ACSS3 在体内的作用，利用 CRISPR/Cas9 技术对小鼠进行了基因敲除。结果显示，ACSS3 的缺失导致小鼠前列腺正常组织发生癌变，前列腺组织中 PLIN3 蛋白水平增加、凋亡细胞比例降低、甘油三酯和胆固醇含量增加、脂滴积聚显著增加。
研究结论
本研究表明，在前列腺癌进展中，ACSS3 通过调节 PLIN3 的泛素化水平而影响 PLIN3 稳定性，进而通过 PLIN3 依赖性信号传导减少 LD 沉积、抑制肿瘤内雄激素的合成，最终抑制 CRPC 进展和逆转恩扎卢胺抗性。
参考文献
Zhou L, Song Z, Hu J, et al. ACSS3 represses prostate cancer progression through downregulating lipid droplet-associated protein PLIN3. Theranostics 2021; 11(2): 841-860.