二代测序FAQ篇
写在前面：
本次更新主要介绍实验过程中或许会常碰到的小疑问。
1.什么时候用NF水，什么时候用TE，二者可以混着用吗？
NF水，即Nuclear Free Water，不含核酸酶的水。Nuclease-free Water (not DEPC-treated) has been deionized, filtered into the final bottle, and autoclaved。这个是参考Thermo Fisher产品介绍即去离子、过滤后经高压灭菌的水。
TE，即Tris+EDTA缓冲液，pH=8.0，经常用到的是1X TE缓冲液， 能稳定储存核酸。
由于EDTA是一种可以和Mg、Ca、Mn、Fe等二价金属离子结合的螯合剂 ，而在PCR中常常用到二价镁离子，所以在做PCR时要用NF水尽量不要用TE洗脱DNA；当我们文库构建完成后，常常用TE缓冲液稳定保存核酸，当然这一步用NF水也没有多大影响。
2.磁珠使用前为什么要进行室温平衡？
磁珠吸附DNA纯化的原理是固相载体固定可逆化（Solid-Phase Reversible Immobilization，SPRI） 技术，简单的说就是磁珠能在聚乙二醇（PEG）和盐离子的作用下可逆的结合DNA[1]。那磁珠为什么要进行室温平衡？引用其他帖子的回答“PEG的DNA沉聚效果容易受到pH、温度等的影响，温度过低PEG也不易与水完全互溶，所以磁珠一般都要求室温平衡后再用”[2]，小编查阅了相关文献并没有说一定要在室温，甚至有研究直接在0℃用PEG沉淀DNA，不过用时12h，分子量小的片段用时会相对少一些，而且在0℃和20℃的沉降效率相同[3]，所以提前平衡至室温也可能跟缩短孵育时间有关。另外磁珠是不能在-20℃保存的，冷冻会影响磁珠的捕获效率。
3.为何末端修复、接头连接以及PCR体系的预混液要在冰盒上操作？
当多个样本一起操作时，经常会进行各步骤预混液的配制，这样的作用不仅可以提高操作速度，同时可以消除单独加试剂产生的差异性。
在冰盒上操作的主要作用就是保持各步骤酶的活性，避免修复/连接/扩增效率降低。
4.为什么纯化过程用的是80%的无水乙醇？
80%无水乙醇主要作用是洗掉盐粒子等杂质。我们之前都学过低浓度（约小于20%）酒精可以溶解DNA，但高浓度（大于70%）的酒精是不会溶解DNA的，所以常常用高浓度的酒精纯化DNA。但是高浓度的话容易挥发而导致浓度下降，另外无水乙醇的纯度是比工业酒精（95%）高，所以常常用到的是新鲜配制的80%无水乙醇。
5.接头连接体系预混液配制好之后可以先加接头进去吗？
不行。如果提前把接头加到接头连接预混液中，会导致接头发生自连，从而消耗接头和连接试剂，使得接头和末端修复产物的连接效率降低，最后文库浓度偏低或者不合格。
6.样本片段化时怎么选择打断程序or酶切时间？
在确定一个样本的打断程序or酶切时间之前要明确该样本的质量，主要是跑胶看其完整性，一般基因组DNA（genomic DNA，gDNA）因其基因组片段较完整，所以一般打断功率和时长都会较长，or酶切时间也是相对较长。而针对福尔马林固定石蜡包埋的样本（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE），由于该样本存在不同程度的降解，根据降解程度一般都会将相差不太大的划分为一个等级，通过跑胶确定其等级之后，可以优化调整打断功率和时间or酶切时间进行片段化。
在没有形成片段化的体系之前，建议先优化出不同等级的样本片段化方案，结合片段分析仪器（Agilent 2100 or Qseq 100等）找到目标片段大小时对应的打断程序or酶切时间即可。
小编之前也在Covaris 超声打断仪上优化过FFPE的打断程序，主要根据你设置的Peak Incident Power（PIP）*Duty Factor = Average Power & Duration有关。
7.片段筛选时为什么磁珠的体积要比DNA的小？
因为片段筛选的主要作用是筛选出接头连接成功的片段，会筛掉一些其他的没消耗完的试剂等杂质，也会去掉没有连接上的接头，主要原因就是，当磁珠体积小于DNA的时，此时磁珠主要是结合DNA相对较大的片段，所以此时磁珠的体积要比DNA的小（一般DNA：磁珠=1:0.75左右，参考Q8)，从而达到片段筛选的目的。
8.磁珠分选不同片段大小DNA的主要原理是什么？
在磁珠分选不同片段大小的DNA时，根据较大的DNA片段更容易与磁珠沉淀的原理，所以当使用磁珠量较少时，磁珠捕获到的DNA片段相对较大，随着磁珠量增加，磁珠捕获到的DNA片段则越来越涵盖相对较小的片段。具体如下图1：
图1 引自参考文献4 Fig 2A。从上到下，DNA片段是从大到小；从左到右，随着磁珠量的减少，捕获到的小的DNA片段越来越少。
9.纯化时弃上清的过程中怎样避免吸到磁珠？
首先可以适当延长在磁力架上静置的时间（如果实验允许的情况下）；其次在用单枪或者排枪吸上清的时候，尽量缓慢匀速的吸，也可以尽量避免吸到磁珠；当然也可以采用大小枪头套用或者换用的方法，套用就是在大枪头下套一个小枪头，换用就是先用大枪头吸取一部分，再换小枪头吸掉剩余的。
10.末端修复和接头连接的预混液加反了怎么办？
如果在末端修复的过程中发现加了接头连接的预混液，则可以停止实验，做磁珠纯化后再重新配制末端修复试剂后重新进行末端修复实验，也可以直接65摄氏度加热30min，使得酶活性消失，再加末端修复试剂重新进行末端修复实验，后需注意片段筛选时体积变化即可（只是建议参考）。
11.如何确定PCR的循环数？
文库构建为了获得较多的满足后续杂交需求的文库浓度，常常会进行PCR扩增，合适的PCR循环数不仅可以得到相对较好丰度的文库浓度，方便后续多文库的杂交操作，还能降低测序过程中的重复率，节约测序成本。
因为不同样本核酸浓度不同，当文库构建时样本核酸的投入量一样时（eg：200ng），只需结合文库浓度和测序重复率优化出合适的PCR循环数即可，当投入量较低时（不能低于最低要求），为了获得合格的文库浓度，则需相应增加PCR循环数。
12.文库构建完成后发现文库浓度偏低是什么原因？
因为文库构建涉及的步骤繁多，每一步操作失误都会在最后测定文库浓度和质量的时候表现出来。所以操作过程中要认真，仔细。如果文库构建完成后是所有样本的文库浓度都低，那可能是之前的步骤（片段化、末端修复、接头连接、片段筛选、PCR）出问题，甚至不排除试剂出问题的可能，如果一定要找原因的话，可以先把片段化的中间产物跑Agilent 2100 or Qseq 100看片段大小范围，判断是否跟打断有关，还可以把文库再加PCR预混业进行PCR，可以判断是否跟PCR有关；如果是部分样本文库浓度较低，也可能跟操作有关，但很可能是跟该样本自身的质量有关系。
下期预告：
下一期打算主要写一写上机测序知多少。
今天来个小插曲→ 实验室的故事2（分享一个面试学到的知识点，主要也跟遗传肿瘤检测相关，后边小编也查了这个问题相关的文献。）
为什么cfDNA片段大小主要在170bp左右？
首先明确cfDNA、ctDNA的概念，cfDNA即circulating free DNA；ctDNA即circulating tumor DNA。
在细胞凋亡或坏死的细胞死亡会导致原生染色质接近完全消化，蛋白质结合的dna片段，通常与组蛋白或转录因子（Transcription Factors TFs）相关，优先在消化中存活下来，并被释放到血液循环中，蛋白酶处理后可从外周血浆中回收碎片[5]。
核小体是有146bpDNA缠绕的组蛋白八聚体，每个核小体之间为50bp左右的DNA连接[6]，一般DNA在两个核小体连接处发生断裂，故cfDNA片段大小主要在170bp左右。如下图2：
当然我们在跑片段分析时，发现cfDNA在360bp附近也有一个很小的峰，这个断裂后剩下两个核小体所致。所以我们构建血浆cfDNA的文库后质检发现经常会出现两个主要的峰，因为加了接头，所以文库浓度峰会在300bp & 500bp 左右。如下图3：
图3 cfDNA 文库片段范围，因为加了接头，所以文库浓度峰会在300bp & 500bp 左右了。
如果有想获取参考文献的童鞋，可以大胆的私信我
。
下期再见！记得给小编打call、点关注。
参考文献：
[1]DeAngelis MM, Wang DG, Hawkins TL. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 1995 Nov 25;23(22):4742-3. doi: 10.1093/nar/23.22.4742. PMID: 8524672; PMCID: PMC307455.
[2]https://zhuanlan.zhihu.com/p/148423335
[3]Lis JT. Fractionation of DNA fragments by polyethylene glycol induced precipitation. Methods Enzymol. 1980;65(1):347-53. doi: 10.1016/s0076-6879(80)65044-7. PMID: 6246357.
[4]Oberacker P, Stepper P, Bond DM, Höhn S, Focken J, Meyer V, Schelle L, Sugrue VJ, Jeunen GJ, Moser T, Hore SR, von Meyenn F, Hipp K, Hore TA, Jurkowski TP. Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation. PLoS Biol. 2019 Jan 10;17(1):e3000107. doi: 10.1371/journal.pbio.3000107. PMID: 30629605; PMCID: PMC6343928.
[5]Snyder MW, Kircher M, Hill AJ, Daza RM, Shendure J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 2016 Jan 14;164(1-2):57-68. doi: 10.1016/j.cell.2015.11.050. PMID: 26771485; PMCID: PMC4715266.
[6]https://baike.baidu.com/item/%E6%A0%B8%E5%B0%8F%E4%BD%93/5491280?fr=aladdin