必看！ 2020年科研中的18个高频问题（一） / 开普饭

2020年快结束了，吉凯基因在此感谢各位老师在过去一年中的大力支持。

2020年的岁末，吉凯基因针对老师们在科研中遇到的一些常见、基础、但又非常重要的问题进行年终总结。搬砖小陈抽丝剥茧，提取出十八个问题，以两期文章阐述，涉及过表达转录本选择、基因下调注意事项、荧光素酶实验、细胞感染、动物实验等多方面问题，希望能帮助老师们在前端设计时避免入坑。

// 一个基因的转录本那么多，我该如何选择进行构建呢？

在NCBI数据库，以人的为例，大部分基因含有的转录本不止一个（如TP53含15个，STAT1含14个），这还不算其他数据库的数据，少量基因能达到百余个转录本，为何转录本如此多产？

前体RNA在剪切的过程中，通过外显子的去除或者保留，产生不同序列的转录本，转录本的产生受到细胞类型、细胞状态，发育时间等因素的影响，也就是众多转录本在一种细胞中往往不会同时产生。少数转录本之间功能不同（如PKM基因的两个亚型M1和M2，在胚胎发育过程中，M2逐渐被M1所取代；在肿瘤发生过程中，M1下调而M2则再度表达， M2在癌细胞中发挥着独特的作用）。如果转录本编码区长度相近，大部分情况下功能是类似的，也就是可以替代使用的。

常规转录本的选择有三点建议：

1. 根据对应的参考文献选择。按照要做的功能，构建参考文献的转录本（大部分文献不会写转录本ID，可以根据蛋白大小、位点信息等确认转录本ID）；

2. 选择编码区较长的转录本构建，因为编码区越长，含有的结构域信息越多，功能也会越全；

3.查询蛋白数据库，里面收录常做的，规范型转录本，如下：

如果想要知道不同亚型之间的差异，可以在NCBI-GENE主页的“Genomic regions, transcripts, and products”图中查阅转录本之间的差异性，解读方式如下：

以NM_000546和为例NM_001276697，前者比后者N端多了三个外显子，编码区多了近159个氨基酸，再结合UNIPROT收录的结构域信息，就知道差异的氨基酸区段跟方框涉及的功能有差异：

要了解更多转录本选择标准，可见《So many transcripts，选择哪个做过表达研究呢？》。

//构建了质粒/病毒，转到细胞，发现WB验证无上调，是怎么回事？

蛋白水平表达效率不高，可从以下几点分析：

1. 质粒/病毒的转导效率是否高？质粒对于大部分细胞，转染效率较低，且随着细胞传代，会逐步丢失；而病毒感染效率也因细胞类型差异而不同，实际操作过程中，建议用载体自带的荧光或者抗性，将未转导进质粒/病毒的细胞去除，再进行检测；

2. 因实验需要，如果质粒/病毒未带荧光，而直接用药物筛选，需要确认药物浓度是否为最佳。在感染病毒前，应做药筛的预实验，摸索最佳药筛浓度，尽可能杀死空细胞。即便目的病毒未带荧光，也建议加一组既带荧光，也带抗性的对照病毒做预实验;

3. 很多细胞都有合适的启动子，如悬浮类用SFFV、干细胞优选EF1A、常规细胞或者肿瘤细胞可选CMV（无法表达于神经元）。老师们多喜欢用商业化载体做构建，如pcDNA3.1、pEGFP-N1等，因为文章好写，但不一定适合自己细胞的表达。吉凯基因将商业化载体改造，得到了比常规CMV启动子表达更强的启动子，解决了很多蛋白表达效率低的问题，由此可见，选择高表达的启动子很重要。

// 做基因干扰，为什么文章被驳回了？

RNA干扰作为下调基因最常用的方式，人尽皆知，但当你觉得文章天衣无缝时，编辑的一句 “Need rescue mutation”或者“Need one more target siRNA”，你又得重新将实验再做一遍。

无论是siRNA，还是CRISPR/Cas9，都存在脱靶现象。以siRNA为例，设计靶点时，设计者会将siRNA靶点与现有核酸数据库中的非靶标序列碱基错配3个以上，以确保靶点不会靶向外源基因。但由于siRNA形成机制与miRNA高度类似，因此，siRNA可以潜在的以miRNA途径，即依靠7bp左右的序列结合非靶标基因，从而产生脱靶现象，而这一过程，blast是无法排除掉的。

因此，为了防止细胞功能变化是因为潜在的脱靶引发的，审稿人要求，要将靶基因做拯救实验---即将siRNA针对的基因做同义突变，再回输细胞进行过表达，看功能是否发生逆转，如果是，就说明功能与靶基因是关联的；当然，也可以用两条有效的siRNA做同步实验，由于两条siRNA序列不同，脱靶至同一基因的概率几乎为零，也能排除脱靶性。详情见《你的RNAi文章为什么被驳回？》。

// 非编码RNA为什么下调无效？

circRNA、lncRNA目前是研究热点，但siRNA下调这类分子普遍较难，主要有以下几大原因：

1.一部分非编码RNA定位细胞核，siRNA路径主要适用胞浆；

2.很多非编码分子表达水平较低，siRNA与靶基因结合是布朗运动随机碰撞结合表达量越低，敲减效率就越低

3.lncRNA含有较严重的二级结构，且多与蛋白结合，影响了siRNA的结合

4.circRNA多为外显子成环，可供设计靶点的区域只有30bp左右，能设计的siRNA及其有限

鉴于以上原因，相对于与mRNA难敲减情有可原。实际操作过程中，尽量多做些siRNA尝试，如果实在无效，只能采取CRISPR/Cas9将lncRNA从基因组上剔除，circRNA可以剔除内含子中促进成环的ALU序列，详情见《学会lncRNA沉默的方法，从此lncRNA研究不发愁！》。

// 启动子为什么默认取2k，可以做长或者短点吗？

实际上，启动子分为两部分：

其一：核心启动子—即含有CAAT box与TATA box的基础转录活性单元，长约100bp，紧挨着转录起始位点（TSS），这段序列是实际上的启动子，构建时必须包含，但是转录活性很低。

其二：启动子调控区—由于核心启动子活性低，而基因表达调控是受启动子上下游的调控序列实现的，比如甲基化、转录因子调控、增强子调控等。我们说的研究启动子，实际上是研究调控区的位置，以转录因子为例，70%~80%的基因，调控区位于TSS上游2k以内，所以我们默认取2k构建。当然，一些基因的调控区位于远端（5k、10k、甚至更长都是可能的），或者内含子中，但如果没有CHIP等实验的验证，盲取是不可行的。如果实验验证转录因子与启动子有结合，但2k无结合，可以延长启动子构建，或者以chip实验分析具体结合区段，再进行双荧光素酶验证即可。

// 验证转录因子与启动子的结合，如何找出具体结合位点？

取启动子时，我们都会以转录因子预测网站如jaspar预测结合位点，并给出相应评分。如果只有少量位点，或者位点之间评分差异较大，则可以直接突变做验证；

但转录因子靠10bp左右的基序结合DNA，预测的结果往往较多，且评分相近，这种想一步到位做突变验证出阳性结合区域是不现实的。标准的做法是，构建启动子截断型、CHIP、EMSA，进一步确认结合区域。