原创|详细解读 CAR T细胞治疗通用生产规程
嵌合性抗原受体修饰的T细胞(CART)免疫治疗在多种血液病和实体瘤中研究，对B细胞恶性肿瘤具有显著疗效。从病人外周血中提取T细胞，进行加工，使其表达嵌合性抗原受体，再现对肿瘤细胞的杀伤作用。随着后期临床试验的到来，CART细胞疗法为更多病人的提供了选择方向，伴随而来的，CART细胞的通用生产要求则成为广泛性讨论的话题。并且，从单个研究机构到大规模多点生产中心制造CART的挑战必须得以解决。在CA19嵌合性抗原T细胞疗法----CTL019这个基础上，已经预料到这样的问题。在本文中，我们将讨论细胞生产过程涉及的技术步骤，包括细胞生产中最佳的使用载量，以及解决嵌合抗原受体T细胞治疗全球病人面临的挑战。（文末有精彩在线分享）
CAR T细胞治疗是一种使病人T细胞重新带有特异性靶抗原和杀死肿瘤细胞能力的细胞疗法。CARs 在基因水平上涉及融合蛋白，包括（1）来自单克隆抗体的抗原识别区域；（2）胞内区T细胞信号和共刺激分子。CART作为癌症的治疗，已经广泛地应用在B细胞恶性肿瘤病人中，早期的结果令人鼓舞。例如，在I期临床，CART细胞疗法在儿科病人、复发或难治性急性淋巴细胞白血病中表现出69% - 90%的完全缓解率。CART细胞治疗的进展现已扩展到第1阶段试验，并进入第2阶段多点试验，科研单位和企业主要的考虑的是如何使CART细胞生产规模化。这里，我们描述了CART细胞生产的过程，并且讨论监管问题，必须解决如何成功地生产大量患者所需求的CART细胞。
CART细胞的生产需要几个详细的步骤，质量控制检测贯穿于整个过程。首先，该方法从患者体内的外周血中分离白细胞，并将其他成分返回血液循环。当白细胞收集足够后，用白细胞分离产品对T细胞进行富集（图1）。淋巴细胞的富集可以通过密度梯度离心法完成，此法根据细胞的大小和密度分离，并保持细胞活力。T细胞亚群的分离通过CD4/CD8特异性抗体或者表面标记偶联磁珠进行分离。更加高效地激活T细胞，可利用CD3/CD28单克隆抗体磁珠或者人工刺激的APCs（aAPCs），这些方法的使用比以前的单独抗CD3 抗体或联合IL-2效果更好。在选择刺激源时同时也可以考虑将T细胞在扩增中极化为特异性表型（例如Th2或Th17）。T细胞激活后，转染编码CAR的病毒载体。病毒载体利用病毒机制连接至病人细胞，进入细胞内后，载体已RNA的形式将基因转导。在CAR T细胞细胞中，此基因编码CAR。RNA反转录成DNA，并永久地整合到病人细胞的基因组；因此，CAR可以在细胞分裂是得以表达，并且在生物反应器中也可以扩增。CAR通过病人细胞进行转录和翻译，且表达于细胞表面。目前，基因整合方式包括有慢病毒、γ逆转录病毒、睡美人转座子系统或mRNA转染、mRNA电转，相对而言，慢病毒有不可替代的优势。生物反应器培养系统的设计，提供最佳的气体交换的要求和细胞扩增所需，满足临床的使用（图2）。目前用于CART细胞培养的生物反应器或系统主要有Wave 反应器、G-Rex及CliniMACS Prodigy。综合实际情况考虑，CliniMACS Prodigy可以完成细胞的制备，富集，刺激，转导，扩增，最终收集和采样，是最适合用于临床试验中T细胞的制备。当细胞扩增完成，细胞培养体积至5L，必须将细胞浓缩至一定体积回输给病人。将清洗和浓缩的细胞冻存起来，接着经过产品放行，冻存细胞运输至目的地再解冻回输给病人。
图1、2细胞培养和转导
虽然临床级别的CAR T细胞生产的操作规程已经建立，但是用于治疗的CAR T疗法只限于很少的一部分病人。如果要应用于更多临床实验、更多病人，这个生产规程则应该更好地进行评估，以保证产品的有效性。因为CAR T细胞仅能用于靶向的癌症，所以载体及CAR T细胞的生产规模也依赖于指征的影响。其他原因还有，修饰细胞的载体，基因治疗的长期安全性以及合适的全球监管措施。
在美国和欧盟，转染CAR的病毒载体是CAR T细胞生产过程的关键性原料，修饰后T细胞被认为是临床实验的最终产品。编码CAR的病毒载体可以大规模生成，低温条件下可长期保存。由于终产品CAR T细胞无法通过过滤来达到无菌，故载体的生产必须在GMP条件下进行，无菌相当重要。以保证最终载体产品和细胞的无菌。批量制造细胞疗法的病毒载体至少需要2周，首先培养足够数量的细胞，如HEK293T细胞，用于质粒转染， 转染质粒通常是（1）GAG /聚合酶包装结构；（2）异种来源编码的包膜糖蛋白；（3）表达病毒辅助蛋白的结构Rev；（4）编码CAR的载体质粒构造以及高效反转录、RNA包装与整合所需的其他序列。载体系统应该采用一些关键的安全特性，全面防止复制能力的再生的可能（例如：密码子优化的GAG /聚合酶，最大限度地减少载体成分之间的同源性，防止病毒重组，长末端重复序列自我失活，并除去所有不必要的序列和辅助基因）。病毒收集后，经过过滤、纯化、去除杂质等，质量合格后，在无菌条件下进行除菌过滤以及分装，最后冷冻保存。
建立针对载体安全性、无菌、纯度、效能、特性以及浓度测定的质量控制试验是非常重要。美国食品药品监督局编写的指导文件对此质量控制试验进行了具体描述。其中包括临床前试验或者动物毒理试验、无菌试验检、复制性慢病毒检测、支原体检测，杂质检测包括核酸酶、BSA、宿主细胞DNA以及质粒DNA。
在CTL019细胞的形成中，单一的载体来源是比较合适的，载体供应商应满足GMP标准以及能够满足大量生产需求等条件。此外，监测保存期间载体滴度是否稳定的稳定性试验是保存期决定性的试验。载体的质量的保证，可以减少工艺验证的风险。为提高转染效能需在T细胞激活，慢病毒需要在细胞激活期间进行转染。载体DNA整合至宿主细胞，致癌基因附近导致的插入突变是一个与所有载体有关的潜在问题。慢病毒整合位点常远离启动子，而逆转录载体整合的位点常位于转录起始位点，说明慢病毒载体有较低变异的可能。目前的研究表明，载体的设计出现RCRs/RCL致瘤的可能性很低。安全角度出发，CART细胞必须检测RCRs/RCL。
图3 慢病毒制备工艺流程
评价细胞及基因治疗的病毒载体的安全性需要进行长期的随访。前面已经提到卫生部门要求病毒载体的长期随访，然而具体要求在各国也不尽相同。例如，美国要求接受CD19CART细胞治疗的的患者需要接受15年随访（NCT02445222），包括任何年龄的患者以及任何类型B细胞恶性肿瘤。随访的首要目的是发现疑似CD19CART细胞相关延迟性的副反应，如新发恶性肿瘤、神经系统或自身免疫系统疾病的新发或进展。随访的其次目的是监测CTL019在外周血持续存在时间以及长期的治疗效果。CTL019细胞可以通过qPCR检测其转基因。第三各目的是监测患者肿瘤的复发或者进展，以及任何原因导致的患者死亡。由于CART的持续存在对妊娠的作用尚不清楚，因此接受CART细胞治疗女性的生殖系统健康以及妊娠的结果也是随访的监测内容。总之，对CART细胞的病毒载体的严谨设计和生产使其安全性能最大化、质量及安全检测以及患者长期随访，确保患者安全乃当务之急。
CART细胞产品的扩展最大的挑战是如何从科研机构走向质量高度可控的生产中心。因此，从标本采集到治疗的之间的合理安排至关重要。CTL019的质控指标包括细胞数量、转染效率、细胞生长率、细胞表型以及功能分析。生产中建立关键的质控点，有利于建立连贯的生产和质控过程，保证产品的均一性。然而，每个产品的CAR阳性率、活力、表型和杀伤均不相同。供应商协议，是维持可控性生产的关键。在CART细胞治疗中，产品的均一性也是挑战，病人单采原料之间的差异较大。因此，我们必须控制CTL019和载体的生产过程，这样才能减少制造过程中产生的差异。
CAR T细胞疗法使病人获益，从而提供不同监管机构国际合作的机会。合规是其发展的关键因素，也是全球化的挑战。FDA多年来一直致力于监管细胞和基因治疗，并发布了相关的指导性文件。一些其他主要国家在审查临床试验时的侧重点不同。参与临床实验的国家越多，就越需要一个切合所有问题和法规要求的稳健生产过程。为了协调细胞和基因疗法的新兴领域，在2012年10月11日，全球监管机构召集成立一个综合小组，讨论细胞/基因疗法的最佳实践。CAR T细胞开发者应对多样化的监管格局有透彻的了解。在建立统一的法规及各地区有着共同经验之前，各个地区的生产存在不同的需求。例如，每个国家在供体的筛选和检验，可追溯性和标识、病人的保密性和单采要求上存在很大不同；另外，各区域对材料的质量控制的要求各不同。平衡不同国家的要求与起始材料的质量要求具有挑战性，但至关重要。因此，解决监管问题，规范CAR T细胞生产材料的使用，以符合全球主要地区的质量要求（例如，在全球地区使用相同的国际供应商）。
CART细胞的副作用有细胞因子释放综合征（CRS），尽管大部分CRS病例是可以控制的，但利用有效机制使CART细胞失活，有助于提高其治疗的安全性。在CAR基因中插入诱导细胞凋亡的开关基因是正在研究的策略，有助于机体可控地清除CART细胞；另一个提高CART安全的方法是提高特异性，尤其是实体性肿瘤中。再有，非同源性“货架型”CART细胞也是一个新的研究策略，利用基因剪辑技术破坏内源性TCRα基因，从而减轻非同源性引起的GVHD。减少衰竭T细胞有利于提高CART细胞的效力。因此，选择CAR信号片段、细胞亚型、调整培养条件来降低T细胞衰竭，对获取高质量CART细胞产品具有重要的作用。
CART细胞在美国治疗B淋巴瘤病人取得的成功，预计会有大量病人接受CART细胞治疗。然而，试图将复杂的细胞治疗生产过程放大至适合全球范围，有许多生产和监管的挑战需要考虑。如果将目前CTL019的CD19 CART细胞生产的应用至全球范围，则需简化生产过程。我们应与学术机构、供应商建立强大的协作来深入调查的产品和生产过程，确保材料受控，保证产品质量。在预期的监管和产品化前，积极地解决这些问题，有利于加快产业化的进程，从而为更多病人提供有保障的治疗途径。
参考文献
Levine BL, Miskin J, Wonnacott K, Keir C.Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy.Mol Ther Methods Clin Dev. 2016 Dec 31;4:92-101.