免疫浸润结合5+分新思路！

T‑cell complexity and density are associated with sensitivity to neoadjuvant chemoradiotherapy in patients with rectal cancer

T细胞的复杂性和密度与直肠癌患者的新辅助化疗的敏感性有关

一、研究背景

  • 新辅助化疗CRT)是II~III期直肠癌患者在直肠系膜切除前所做的全身化疗。一些患者对CRT反应完全，可以避免手术；而另一些患者反应不佳，甚至会提高与CRT相关的潜在发病率或产生其它有害功能的后果。

  • T细胞介导的适应性免疫反应在肿瘤进展中起着重要作用，较高密度的CD8+ 肿瘤浸润淋巴细胞(TILs) 已被报道与直肠癌患者较好的预后有关。

  • T细胞受体(TCR) 序列的复杂性可以作为特定类型癌症的预后和治疗反应的生物标志物，但没有研究评估TCR库对直肠癌CRT后反应的影响。

  • 本文试图量化，对于接受CRT治疗的晚期直肠癌患者，TCR库复杂性的作用，并探讨其与治疗反应的相关性，以及研究TCR库在CRT前后发生的变化。

二、研究流程

三、结果解读

1、TCR库与CRT反应的关系

多样性指数被用来评估肿瘤中TCR库的复杂性，按多样性指数排序后，以颜色图的形式显示治疗前活检样品中前10个克隆型的频率。多样性指数在颜色图下方显示为热图，同时下方还显示了每个样品的肿瘤消退等级（TRG），微卫星不稳定性（MSI）状态和POLE核酸外切酶（exo）域的突变状态（图1a）。

  • 根据Dworak的肿瘤消退分级标准 (TRG)评估CRT后外科手术前的反应的：TRG1，显性肿瘤肿块，明显纤维化；TRG2，显性纤维化改变，肿瘤细胞很少；TRG3，纤维组织中很少（很难在显微镜下找到）肿瘤细胞；TRG4，没有活的肿瘤细胞。分级为TRG4和TRG3的标本被归类为“良好的应答者”，而分级为TRG1的标本被归类为“无应答者”。

  • MSI 是由错配修复 (MMR) 基因发生缺陷引起的，与肿瘤的发生密切相关。大约 15% 的结直肠癌中存在 MSI-H 现象，与 MSS 特征的结直肠癌相比，其发病机制、预后和对药物的敏感性均不同。

前10种克隆型的频率在1.9%到 89.7%之间，表明患者之间肿瘤内TCR多样性存在高度变异性（图1a）。接着，作者对比了良好应答者 (TRG 3/4) 的多样性指数与无应答者的(TRG 1) ，发现良好应答者 (TRG 3/4) 的多样性指数明显高于无应答者(TRG 1)  (P=0.0309），即良好应答者中的TCR库更复杂。

接着，作者又对比了ypN阴性患者与ypN阳性患者，以及II期患者（ypT0-2）与III期患者（ypT3-4）的多样性指数。发现ypN阴性患者的多样性指数显著高于ypN阳性患者，并且ypT0-2的多样性指数往往高于ypT3-4，即ypN阴性患者与II期患者中TCR库更复杂（图1c） 。

然后，作者进一步探讨了TCR多样性指数与预后生存周期的关系，发现，术后74个月左右，TCR多样性指数的高低在生存曲线上并无明显差异（图1d）。

图1：TCR库与CRT反应的关系

2、TCR库多样性与突变/抗原负荷无正相关

作者考虑到突变负荷与CRT敏感性之间有正相关关系，于是推测突变负荷与TCR复杂度之间也存在正相关关系，因此使用 NetMHCpanv2.8 预测新抗原，发现存在四个超级突变体，其中两个MSI-H突变，一个POLE校对结构域突变，还有一个同时存在两种突变（图1a）。

  • 移除四个超级突变体后，作者观察到单核苷酸变异与插入突变之比（SNVS/indels）以及新抗原的数量与多样性指数都没有相关性（图2a，图2b）。

图2：TCR库多样性与突变/抗原负荷无正相关

3、TCR库多样性与CD8+TIL密度的关系

作者使用Mann–Whitney U test计算P值，验证了CD8+  TIL密度与CRT后具有良好响应(TRG3/4)有正相关关系（图3a）; 使用Spearman相关检验计算Rho和P值，发现多样性指数与CD8+  TIL密度之间有很高的关联趋势（图3b）。接着，采用JMP软件的Logistic回归模型进行单因素和多元分析，评价CRT反应的预测因子, 作者发现CD8+ TIL密度较高和T细胞库更复杂的患者更有可能对CRT具有良好响应 (TRG3/4)（表1）。

为了探究病患CD8+ TIL密度高低与TCR库复杂程度对CRT疗效的影响，作者将样本分成四组，发现 CD8+ TIL密度高与TCR库复杂（TILhi/DIhi）组对CRT具有更良好的响应, 而TILlo/DIlo组对CRT的响应较差，至于TILhi/DIlo组和TILlo/DIhi组则表现平平。此时，使用卡方检验与Fisher的精确检验得到P<0.0001。 因此，作者推断，CD8+ TIL密度和T细胞库复杂性两者交互作用影响CRT疗后的响应（图3c）。

图3：TCR库多样性与CD8+TIL密度的关系

4、TILhi/DIhi组与TILlo/DIlo组基因表达的差异

在R/Bioconator中，作者使用SAGx包获得了组间微阵列中差异表达的基因，绘制热图。由 Benjamini and Hochberg方法得到当q<0.1时，在TILhi/DIhi组与TILlo/DIlo组分别存在108和743个基因表达上调。

接着，作者通过Cohen kappa coefcient计算，使用在线平台Metascape进行GO分析（图4b），观察到在TILhi/DIhi组，表达上调的基因显示与“白细胞激活”，“免疫应答激活细胞表面受体信号传导途径”和“细胞因子信号传导途径”有关；而在TILlo/DIlo组，是与“核糖体生成和组装”有关的。这些发现暗示了免疫学过程与TILhi / DIhi肿瘤的CRT敏感性相关。

5、CRT前后TCR库的变化

最近研究表明，将肿瘤细胞暴露于辐射中会引起新抗原的产生和对肿瘤细胞免疫过程的激活。于是，作者想要通过测量CRT前后多样性指数的变化，从而研究CRT对TCR库的影响。

作者根据CRT反应来评估多样性指数的变化时 ，发现无应答者 (TRG1患者 ；P=0.0074)在CRT后多样性指数显著增加，而良好的应答者(TRG3/4患者；P=0.6875)没有显著改变 (图5a)。而且，在CRT中，多样性指数的增加或减少都不显著影响患者预后生存(图5b) 。

接着，作者使用R包divo中的Morisita-Horn 指数来评估CRT前后TCR库的相似性， 发现，良好应答者(TRG3/4)和非应答者(TR G1)(P=0.6828)之间的Morisita-Horn指数没有显著性差异，但复发患者的Morisita-Horn指数往往高于无复发者（图5c)；同时，Morisita-Horn指数较高的患者表现出较短的RFS，这可能表明CRT期间TCR库的改变程度是一个重要的预测预后的因素（图5d）。

小结

作者应用TCR-β测序技术，对直肠癌患者CRT治疗前后使用多样性指数来评估肿瘤中TCR库的复杂性，使用the Aperio Image Scope system 评估CD8+ TIL 密度，发现CD8+ TIL密度和TCR多样性指数分别与CRT的良好预后有关，并且两者存在交互作用。为了防止突变负荷对TCR库复杂性产生影响，作者使用 NetMHCpanv2.8 预测新抗原，移除突变体后发现并无相关关系。接着，作者用SAGx包获得了TILhi/DIhi组与TILlo/DIlo组差异表达的基因，并且使用GO分析绘制了与基因相关的通路。最后，作者通过测量CRT前后多样性指数的变化，发现CRT前后TCR库的较大变化与较好的无复发生存率正相关。

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