图9. 哺乳动物生殖细胞和早期胚胎发育过程中 DNA 甲基化的动态变化 [9]图 9 中可以看到,上面是细胞的生命周期,从一个受精卵到形成一个新的生殖细胞;下面是 DNA 甲基化的模式,精子、卵子形成合子,发育到桑椹胚时,除印记基因外大部分的 DNA 甲基化都被抹去。然后开始分化出不同的胚层,重现甲基化模式,再到机体的形成;在形成的过程中,新的胚胎发育,卵细胞、卵巢又重新形成,里面又有新的原始生殖细胞。
图11. 正常组织样本及其肿瘤的特征聚类 [11]图 11b 中有脾脏、肝脏、脑组织,可以看到不同组织间 DNA 甲基化的特征有一样的,也有不一样的,说明 DNA 的甲基化有组织特异性,准确的说也有细胞类型特异性。同一种细胞比如说纤维细胞,在不同的器官中,它的甲基化谱比较像,但也有不一样的地方。当肿瘤发生后,比如正常的结肠组织和结肠癌,你会发现它们彼此之间虽然有差别,但还是非常像(图11a),这对于我们研究肿瘤具有很现实的意义。举个例子,大概5、6年前,我开始找胃癌转移相关基因,对于有淋巴结转移和没有出现淋巴结转移胃癌病人,我比较原发灶,看它们两者之间有什么差别。如果原发灶里面有很爱转移的肿瘤细胞,我就可以逮住它,以后就可用来预测肿瘤转移,我们后来把它做成功了[12]。但有一个日本的课题组,他比较的是原发灶和淋巴结转移灶,他觉得这两者之间差别应该更大,但他恰恰忘了,肿瘤细胞到淋巴结以后虽然也很像原发组织,但里面肯定掺杂了很多淋巴结的组织成分,产生了很多变化,而这些变化其实是淋巴结组织本身拥有的,或者是肿瘤细胞跑到淋巴结以后,为了适应淋巴结内环境,促使其发生的变化。他做了很多努力,但还是以失败告终。肿瘤组织跟它的正常组织之间很像,所以它们那些细微的差别才是肿瘤特有的。你要是比较不同组织间的表观遗传特征,只能说这两个组织之间有什么差别,不能用于肿瘤转移研究。现在有很多人提出“异病同治”这么一个概念,尽管肿瘤长在全身不同的地方,但可能用同一种方案治疗。我不反对这个说法,但是“异病同治”这个方法首先就抹杀了肿瘤跟它起源组织之间的差别,我们对此要非常谨慎。
图12. 肿瘤的组织起源决定了其组织特异性的 DNA 甲基化模式 [13]另一个例子,来证明这件事情,肿瘤的组织起源决定了其 DNA 甲基化模式[13],正常组织变成肿瘤以后,它跟它原来的家庭出身是那么相像,永远抹不去。大家基本已经接受了这个理论。上面我们有提到鳞状上皮的结构,上面是鳞状上皮,下面结缔组织;而在肿瘤组织里基本上见不到结缔组织了。结缔组织的表观遗传特征跟鳞状上皮的表观遗传特征有非常大的差别。当我们说肿瘤组织出现了某种正常组织没有的变化时,那可不一定是肿瘤特异性的,也可能像这样是因为结缔组织变少了造成的。这个时候要特别小心,我们要区分这个地方是组织结构造成的,还是肿瘤细胞里面发生的变化。当然如果你不关心间质的时候无所谓,如果你要关心间质,要么要间质和间质比较,上皮跟上皮比较。大部分肿瘤起源于上皮组织,上皮来源的肿瘤细胞和正常上皮两者之间有什么变化,这样比较才不会陷入组织细胞结构性变化造成的差异。肿瘤间质也是如此,正常间质是什么变化,肿瘤间质是什么变化,分别比较不会陷入这种问题。很多人说,我取一个肿瘤组织,再取一个切沿的正常组织,这个基因就有表达差异,但这个是肿瘤细胞造成的变化还是间质结构发生的变化,这个必须分清楚。这个是要借助于免疫组化或者是共聚焦鉴定,到底是肿瘤细胞还是间质细胞发生了这种特异性变化。不把这个事情做清楚,那些东西没有意义。全基因组 DNA 低甲基化然后再说全基因组 DNA 低甲基化。我们以前在做化学致癌的时候,用致癌物处理细胞或动物四到六个小时,全基因组甲基化水平一下子就降了很多,这是肿瘤非常显著的表观遗传特征;同时,基因组的稳定性就下降了。全基因组低甲基化和基因组稳定性显著下降,它们之间有没有内在的关系?这个问题到现在也没有搞清楚。如果它们是一回事,那很可能我们研究基因组不稳定性就找到了一个突破口。我们在做致癌的时候,根本不需要看几年以后的变化,就直接看几个小时以后的就OK了。怎么看?动物喝下致癌物后,你看它全身哪个组织发生了低甲基化,那个地方就是它的靶器官,未来很可能要长肿瘤,基本上就是这样。低甲基化和全基因组不稳定性都是早期现象,那时候肿瘤还没有发生。这时候我们再回过头来,那可能是一种细胞的应急反应,发出 “SOS”。很久很久以前我们还是单细胞,每个细胞都是全能的,既要适应环境,还要繁衍后代。但自打我们变成多细胞生命体以后,细胞就分工了,除了生殖细胞还保留全能性,组织干细胞保留了部分的全能性,很多细胞的全能性被压制了。比如在一个群体中,组织运营很好,大家生活的很快乐;但是当环境迫使其中少数人不适合当前的生存环境,当然也可把它消灭掉;但万一没消灭掉,或者很多人都感受到不安全了,那就要造反了。“SOS 反应”就是说,全基因组低甲基化也好,基因组稳定性降低也好,本质上都是说我在你这里活不下去了,我得独立自主,恢复我的全能性。我们每一个细胞,原来都拥有全能性,仅仅是为了不同组织的分工,牺牲了自身的全能性。当有致癌物,让你活不下去了,那肯定要造反,不服从分配了。我觉得肿瘤细胞,就是部分恢复了它的本来面目,部分恢复了它的全能性。所以全基因组低甲基化,是这里面值得研究的一个地方。
图13. 人类基因组的成分 [14]全基因组低甲基化发生在哪?以前没有基因特异性的分析方法,我们只知道甲基化水平下降了,但到底降在哪儿没有人去管。图13是我们的基因组的成分,1.5% 为蛋白编码基因,98.5% 的基因不编码蛋白;还有很多是重复序列,比如说 20.4% 是 LINE,LINE 是比较长的,散在分布的重复序列;还有 SINE,SINE 是比较短的,300bp 左右,每一个 Alu 中含有 24 个 CpG 位点,Alu 散在分布的重复序列。我们还有不是分散分布的重复序列,比如端粒,它是串联存在。LINE 和 SINE 占了我们基因组的三分之一,还有很多其他的转座子,我们都没去关注它。其中 SINE 里面有一种序列叫 Alu。Alu 序列是我们体内拷贝数最多的一个基因,我们每一个正常细胞中大部分基因是单拷贝的,但 Alu 有 160 万个拷贝。我们基因组里面三分之一的 CpG 位点都在 Alu 里。所以说全基因组低甲基化到底发生在哪?是不是在这些重复序列里头,或重复序列起到了主要的贡献。很可惜,测甲基化的人很少关心它。早期用芯片时,一定要把 Alu 去掉,因为它是高度甲基化,会影响目的基因的观察。现在不管是 Illumina 450K 芯片还是最新的 850K,从来不关心它。现在我们回想一下,我们测出来有变化,病人就活得长;没变化的,活得不长。那是因为我们缺失了对全基因组不稳定性或全基因组低甲基化的关注,这件事情要重新引起关注。当我们发现蛋白编码的基因是如此之少时,我们要反思我们这么聪明,跟别的动物不一样,难道就靠这 1.5% 的编码蛋白?如果单看编码基因的多少,我们跟一只苍蝇差不多;但比较非编码区域时,它们肯定没我们多,比我们差远了。现在我们已经开始关注这些非编码区域,也陆续开始发文章。Alu 序列是一种逆转座子,能通过逆转录反复地插入到基因组里面,功能上除了控制全基因低甲基化以外,还可作为核小体的定位装置。我们知道染色体是以核小体为基本单元的,核小体在基因组的位置基本上是固定的,尤其是转录起始点附近。没有转录起始点的地方通过 Alu 来定位,每一个 Alu 序列对应一个核小体,它散布在我们基因组里面,像停车场立的桩子,每个车位之间都要划线,但有的是三个桩子,有的是两个桩子,它往那个地方一占就停不了车。每一个 Alu 序列对应一个独立的核小体,它是核小体的定位装置[15]。在 DNA 进行半保留复制时,双链解聚形成复制叉的地方是一个 Alu 序列。更重要的是, Alu 在有性繁殖过程中也发挥作用。不止我们人类,单细胞生物就开始了有性繁殖。为什么会这样?因为不同的两个生命体之间可以进行基因重组,可能获得了必不可少的生长优势。怎么重组?Alu 序列是一个重组位点,因为全基因组中有那么多序列相同的东西,跟你匹配马上就交换了。在显微镜下你去看,姐妹染色单体交换那个点肯定就是在 Alu 上。转座(translocation)的热点基本上也在 Alu 上[16]。我们年老后,基因转录水平降低,为了弥补蛋白质的量,谁来干这个事?Alu 会转录出 RNA 来,虽然它本身不编码蛋白,但可普遍增加蛋白翻译的效率。总之,我们对 Alu 作用的重视还不够。
图14. Alu 序列的演变过程 [17]我们刚才提到基因中 1/3 的 CpG 位点在 Alu 序列中,但多数 Alu 发生了变化,某些 CpG 位点会发生脱氨基,在体内演变成 200 多种不同的 Alu(图14)。尽管如此,在 Alu 里面 GC 含量仍然非常高,是非 CpG 岛区的 8 倍,这说明一件什么事情呢?我们基因组中的胞嘧啶,如果无关紧要,它很可能会脱氨基就变成胸腺嘧啶,这也是为什么大部分突变发生在胞嘧啶上,这会进化出新的基因来,是基因进化的动力。为什么 Alu 序列里的 CpG 位点胞嘧啶没有脱氨基,而是进化过程中被保留下来?没有脱氨基的 Alu 才能传递下去,这说明了甲基化的重要,也提示 Alu 不是简单的重复序列,它是有功能的。
图15. Alu 元件的胞嘧啶脱氨基化 [18]早期很多人测 Alu 的甲基化,总是看不到很好的结果,主要原因是分析 Alu 序列的方法不成熟,大家忽略了 Alu 真实的甲基化位点在哪里。图 15 最上方是一个标准的 Alu 序列里面的 24 个 CpG 位点,有些已经突变了脱氨基了,但是总的来看比如 I 位点基本上全突变了,没剩下多少维持下来,甲基化很低;而 A、D、O 这三个位点,还保存在那里,大部分甲基化。用这个方法来测体内 Alu 甲基化情况可能会更准确,整体仍看不到什么好的结果,我们觉得考虑应该具体到基因,即基因组中哪一段 Alu 序列变化会影响生命的过程,影响基因的表达模式,这样研究才会有意义。这已经超出了我们研究单个基因的表观遗传修饰的概念,这是从基因所处环境控制基因表达的角度研究。当我们把 1.5% 的蛋白编码基因理解成种子,把其余 98.5% 的序列理解成土壤,从这个角度才能解释这些非蛋白编码区的低甲基化状态改变如何影响细胞的生命,如何使得细胞生存下来。不管是同源重组还是非同源重组,突变是进化的动力;而肿瘤为了生存下去,要演变出很多突变,这从逻辑上解释得通,但需要提供证据——哪些位置低甲基化了,突变率就变高,而逆转这个过程是否就不发生突变了。CpG 岛甲基化状态变异我们研究比较多的是转录起始点附近的 CpG 岛,主要位于启动子区。我们常说的启动子甲基化往往指 CpG 岛甲基化,但不排除第一外显子,有的 CpG 岛就是跨第一外显子的。我们对非启动子区甲基化研究很少,在第二外显子第三外显子等相对保守的区域,也有 CpG 岛存在,但它们有没有功能?是否影响染色体的构象或者是否会影响基因剪接、染色质重塑过程?这些还不清楚。一个基因要表达,转录起始点附近的 CpG 岛(一两个核小体范围内)不能甲基化;如果甲基化,就转录不了,没有例外。有些人说我拿一个组织,在特定位点测出了甲基化,但发现 RNA 转录了,这是犯了概念性错误,当我们说一个启动子甲基化了,基因不能转录,那是指在同一个分子上;而描述一块组织时,一个组织里有成千上万个分子,有些甲基化了,而另一些没有甲基化但可以转录,即使检测到转录出的 RNA 也不能说明什么。一般来说,研究 DNA 甲基化是否影响基因的转录活性用细胞系比较好,虽然不是完全均一,但相对来说比较均一,代表性会比较好。一些单细胞组学等新技术出来后,可能会修改一些看法。很多那时候在组织中也可以看到相关性,但没有看到相关性也不能否定甲基化对转录的抑制作用。其意义在于在 DNA 水平上我们研究基因的可转录性,而不是真实的转录情况,因为一个基因要转录除了没有甲基化外还需要转录因子辅助才可以,未甲基化提供了一个可转录的状态。我们都知道 DNA 非常稳定,在血和毛发甚至化石中都可提取 DNA。因为 DNA 甲基化通过 α-键共价结合,跟 DNA 一样非常稳定,因此 DNA 甲基化的检测对样本的要求很低。此外甲基化序列与非甲基化序列可以用不同的方法分别分析,互不干扰,因此可以对少数细胞的变化进行准确灵敏的分析。羟(去)甲基化能力降低肿瘤里有一个特征,羟甲基化大幅度下降。而现在的 DNA 去甲基化通过糖苷酶切除一段 DNA,又重新复制和连接回去,是一种极其浪费的模式;最简单的是把羧基脱下来,直接一步完成。受精卵分裂成八细胞的过程中,把所有的甲基化需要全抹掉,羟甲基化也在其中,如果这样切,双链 DNA 会切成碎片,事实上不是这样的,如果这种核苷酸切除修复途径真存在,也是单链上进行,不会两条链同时进行,但还没证据。我在 2014 年的综述《DNA 甲基化和去甲基化的研究现状及思考》中专门讨论了这个问题[19]。在肿瘤组织中,之所以会羟甲基化水平降低,可能是 TET1 自身发生甲基化而失活,也有可能是 TET2 发生突变。我们自己的工作发现,用常规的分析方法,P16 甲基化和羟甲基化在早期与晚期肿瘤之间没有差别,但是把羟甲基化与单纯甲基化分开,每个都有差异,提示有些羟甲基化标志在肿瘤中可以保留下来。肿瘤表观遗传标志物表观遗传修饰有很多,但直到今天能往肿瘤标志物上靠的只有 DNA 甲基化,因为研究的技术手段成熟,还有上面提到的一堆优点。组蛋白修饰确实很重要,但目前的研究方法主要基于抗体,把某种修饰的组蛋白拽下来,然后提取 DNA 进行 PCR 扩增,判断某个位置的修饰情况。用抗体的结合是一种间接的证据,并没有直接看到某段核小体上组蛋白是否发生修饰。目前组蛋白修饰还难以作为肿瘤标志物,顶多推测一下某种组蛋白总体的变化跟肿瘤转变的关系。大约 20 年前,miRNA 成为明星分子,大家对它期待很多,期待最多的是 miRNA 能否导致表型变化。是不是吃下去 miRNA 就能把某个基因关掉,就能把病治好,但至今没有听说过类似研究,只是有些研究表明 miRNA 局部渗透到达一些细胞里可以干扰基因的表达变化。虽然有科学家说,植物的 miRNA 可调控人体细胞基因的表达,甚至说那可能是一种营养素,我不认同这一点。今天讲表观遗传标志物时只讲 DNA 甲基化。表观遗传标志物可以用来干什么呢?我们刚才介绍了肿瘤发生的多阶段性,不同阶段有不同的用处。
图24. miR-26a 可用于区分α-干扰素对肝癌的疗效 [32]另一个表观遗传标志物——miR-26a 也可以用来预测疗效。乍一看发现 α-干扰素治疗肝癌病人会有效,发现队列和验证队列都有效。仔细一看,你就会发现,只有对 miR-26a 表达很低的病人用 α-干扰素治疗才有效,不管是发现队列还是验证队列;当 miR-26a 表达量很高时,没有效果[32]。这类标志物很大的价值就在于在临床上,对于大量的肿瘤患者,可以判断什么时候用什么药。肿瘤的表观遗传治疗最后一部分我们讲解表观遗传的治疗。现在已经出现了很多表观遗传药物,很可惜早期的 DNA 甲基化阻断剂比如 5-Aza-C 已经被发现了几十年,它除了干扰 DNA 甲基化,还能干扰了 mRNA 的合成,所以毒性比较强。后来就进一步发展为 5-Aza-CdR(商品名,地西他滨 decitabine),不会干扰核酸,只干扰脱氧核糖核酸。最近发现低剂量的使用才是 5-Aza-CdR发挥作用最好的方式,已批准用于治疗骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndromes,MDS),而且跟化疗药物组合在一起可能有比较好的疗效。刚才我们提到组蛋白修饰没办法用来做肿瘤标志物,但组蛋白去乙酰化的药物一批一批的出现。其中西达苯胺(Chidamide)是中国研发的药物[33],已经在中国和美国上市,主要应用在外周T淋巴瘤上。还有一种是针对 EZH2 的药物,EZH2 是催化 H3K27me3 的一个蛋白,它也有抑制剂,但能否走向临床还不知道。SIRT1 的激活剂白藜芦醇[34],是葡萄酒中的抗氧化剂,也是一个表观遗传调节剂,但能不能作为一个治病的,值得深入的研究。2015 年有一个令人兴奋的研究。现在肿瘤的免疫治疗很火,这项研究发现 DNA甲基化阻断剂还有一个奇特的作用。我们的基因组里有很多逆转录病毒整合进去,外源整合的 DNA 通过甲基化沉默掉,但 DNA 甲基化阻断剂一上去就发现,这个逆转录病毒整合的基因去甲基化了,被激活了,能够表达出 RNA 来;而细胞会识别它,就会对干扰素变的易感[35],所以这是 DNA 甲基化阻断剂给肿瘤免疫治疗创造机会的一种机制。
图25. DNA 甲基化抑制剂通过激活逆转录病毒增强肿瘤对免疫治疗的敏感性 [35]逆转录病毒元件不仅存在于肿瘤细胞中,也存在于我们体内的每一个细胞中,那么这个甲基化阻断剂进去后把每一个细胞的逆转录病毒整合基因都激活了,那么是不是敌我不分,杀死肿瘤的药物也会把正常的组织杀死?当然我们可以改良,可以局部注射,减少对全局的损伤,但这种途径至少创造了一个机会。
图26. 特异性的 P16 基因去甲基化激活 P16 表达,抑制肿瘤侵袭和转移 [36]那么这是我们自己的一个例子。我们都知道 DNA 甲基化不是一种突变,可以被抹掉,除了 DNA 甲基化阻断剂阻断以外,我们可以采用基因特异性的去甲基化的方法。用 5-Aza-C 的时候,没有特异性,把全基因组甲基化全抹掉了,肯定是有毒性的。但如果我认为这个甲基化非常重要,做一个基因特异化的 DNA 甲基化,就奔着这几个基因去了。首先设计了一个锌指蛋白,可以特异性结合到 P16 基因上去,然后把它和 VP64 结合到一起,加上核定位信号;构建的载体进入宿主后入核,确确实实发现这些基因被激活了,共聚焦可以看的很清楚,激活以后抑制了细胞的侵袭和转移[36]。利用这个我可以做一个什么事呢?口腔黏膜一般我可以贴膜,口腔溃疡有贴膜的治疗方式。是不是我这个东西贴上去也能把它激活呢?就用这么一个简单的方法,做了这么一件事。还存在一个鸡和蛋的问题。有人说,DNA 甲基化是伴随着基因沉默发生的现象,那么它自身在基因转录上到底有没有功能呢?所以我们就是觉得我们手上有这么一个基因特异性结合蛋白,我们就把这个 P16 基因构成了一个特异性甲基化酶(DNMT3a 的催化结构域),转染细胞发现 P16 基因表达降下来。P16 甲基化以后,细胞的迁移能力变快了(增殖不受影响)。将 P16 甲基化的细胞注射到小鼠尾静脉,发现无论肿瘤变大,肿瘤转移会加速。我们这个结果回答两个问题,第一,P16 甲基化是直接抑制基因的转录;第二,P16 的甲基化促进肿瘤侵袭和转移[37]。
图27. 在小鼠肿瘤生长和转移模型中全基因组 CRISPR 筛选策略 [38]最后分享一项很受启发的工作,来自张峰课题组。他们设计 67450 个 gRNA,然后包装成逆转录病毒库去感染细胞,理论上每个细胞内会有转入几种 gRNA,相应地几个基因会被失活。然后把这些细胞混到一起,然后种到小鼠身上,看长出来的肿瘤里面到底哪个基因失活,最后发现一个是 Pten,一个是 p16,就是在转移性癌细胞里面大多带有这两个基因的突变,提示这两个基因有促进肿瘤生长和和转移的作用[38]。以前没有人敢说 P16 基因可以促进肿瘤的转移,但事实就放在那。而我们的工作告诉大家,P16 的甲基化也有类似的作用。这就是我们在肿瘤治疗上做的一点工作,又做了一点功能。就是这些,谢谢大家。文稿整理 | 澳门科技大学 彭宇中,中山大学肿瘤防治中心 陈梦珂,中科院遗传与发育所 战珍萍全文统筹 | 复旦大学生物医学研究院 徐鹏参考文献:1. Bell, R.B., P.E. Andersen, and R.P. Fernandes, Oral, head and neck oncology and reconstructive surgery. 2017.2. Hanahan, D. and R.A. Weinberg, Hallmarks of cancer: the next generation.Cell, 2011. 144(5): p. 646-74.3. Kim, J.H., et al., Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease. Nature, 2002. 418(6893): p. 50-6.4. Correia, A.S., et al., Stem cell-based therapy for Parkinson'sdisease. Ann Med, 2005. 37(7): p.487-98.5. Knudson, A.G., Two genetic hits (more or less) to cancer. Nat Rev Cancer, 2001. 1(2): p. 157-62.6. 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