实验流程|神经类器官
脑类器官是体外3D模型，其细胞组成和结构组织能代表发育中的人脑。使用STEMdiff™脑类器官试剂盒可从人多能干细胞（hPSC）诱导生成脑类器官，整个过程基于Madeline Lancaster发表的实验流程 [1,2] 并经过优化，用以提高类器官的生成效率和实验重现性。该流程描述了如何从hPSC诱导生成脑类器官，这些脑类器官具有明显的边界，紧密的细胞排列，和小于10％的分化区域。
实验材料
第一阶段：类胚体的形成（第0-5天）
准备EB Formation Medium，将10 mL的STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement A添加到40 mL的 STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 1中。
使用显微镜观察确定分化的区域。通过用移液管尖端刮擦或通过抽吸去除分化区域。
吸除培养基，使用PBS润洗细胞。
吸去润洗液，加入1 mL的GCDR。
37°C孵育8 - 10分钟。
注意事项：请注意对于不同的细胞系或者使用不同的无酶细胞传代试剂，孵育时间也会有所不同。
使用1 mL移液枪，轻轻重悬细胞，上下缓慢吹打3 - 5次。将细胞悬液转移至50 mL离心管中。
制备EB Seeding Medium，在EB Formation Medium中加入10 µM的Y-27632。
加入1 mL EB Seeding Medium润洗培养孔，一并加入离心管中。
300 x g，离心5分钟。
弃去上清。加入1 - 2 mL的EB Seeding Medium重悬细胞。
使用台盼蓝（Trypan Blue）和细胞计数板进行细胞计数。
计算获得90,000个细胞/mL所需的细胞体积；将此体积的细胞添加到适当体积的EB Seeding Medium中。
在96-well round-bottom ultra-low attachment plate的每孔加入步骤12中制备的100 μL细胞悬浮液（9000个细胞/孔）。 注意事项：为了提高EB的形成效率和重现性，建议使用多通道移液器进行此步骤。 在37℃下孵育96孔板。24小时内不要移动培养板。24小时后，应观察到小EB的形成（直径100 - 200 μm左右）。 在第2天和第4天，每孔加入100 μL的EB Formation Medium。这一步建议使用多通道移液器。37℃下培养。 第5天，在显微镜下观察EBs。EB的直径应大于300 μm(通常为400 - 600 μm)，并表现出圆形和光滑的边缘。这些EBs可以进行第二阶段的操作。
准备Induction Medium，将0.5 mL的STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement B添加到49.5 mL的STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 1中。 在24-well ultra-low attachment plate的每孔加入0.5 mL Induction Medium。 在24孔板中每孔加入1 - 2个EBs，如下: 使用wide-bore 200 µL枪头，从96孔板（第一阶段）中每孔吸取50 µL液体获取EB。 小心的移除大部分液体，将EB留在枪头内。
将EB分配到含有Induction Medium的24孔板中。 注意事项：在孵箱中前后晃动培养板3 - 4次，将EB均匀的分布在孔中。接触到一起的EB更容易合并。如果合并的EB数量较多，则每孔只加入一个EB。 37℃孵育48小时。在Induction Medium中生长两天后，EBs应该是肉眼可见的（直径500 - 800 μm左右），并具有光滑、半透明的边缘。这说明神经上皮的形成。这些EBs可以进入第三阶段的培养。
将Matrigel®在2 - 8°C，冰上解冻1 - 2小时。
注意：解冻足够的Matrigel®，保证每个EB具有15 μL Matrigel®（如96孔 x 15 μL/孔= 1.44 mL Matrigel®）。将Matrigel®保存在冰上，以防止过早凝固。所有与Matrigel®接触的塑料器皿在使用前应在-20°C下至少冷冻30分钟。
准备Expansion Medium，将0.25 mL STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement C和0.5 mL STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement D加入到24.25 mL STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 2中。
在一个无菌的100 mm培养皿中加入一片无菌的Organoid Embedding Sheet。
注意事项：也可以用Parafilm®创建一个embedding sheet。
使用wide-bore 200 µL枪头，从24孔板的一个孔中吸取25 - 50 μL的培养基 EB，并转移到embedding sheet上。重复此步骤，直到将12 - 16 EBs放入embedding sheet。
注意事项：每次操作不超过12 - 16个EB；这将防止EB干燥和Matrigel®过早凝固。
使用一个标准的200 µL枪头，吸除每个EB外多余的培养基。枪头朝向EB的另外一侧，避免接触到EB。
使用带有200 µL标准枪头的移液枪，每个EB上加入15 µL Matrigel®。
使用一个新的冷的200 µL移液器吸头，重新将EB定位到液滴的中心。
37°C孵育30分钟，等待Matrigel®凝固。
使用无菌镊子提起含有Matrigel®凝固液滴的embedding sheet。
将embedding sheet对准一个6-well ultra-low adherent plate的一个培养孔。使用1 mL移液枪，吸取Expansion Medium并轻轻地将Matrigel®液滴从embedding sheet上冲到培养孔中。每孔使用3 mL Expansion Medium。重复上述步骤，每孔可培养12 - 16个Matrigel®包埋的类器官。
37℃下孵育3天。包埋的类器官会发育扩展生成神经上皮结构，在EB表面表现为出芽状。这些EBs可开始进行第四阶段的培养。
准备Maturation Medium，将2 mL的STEMdiff™ Cerebral Organoid Supplement E加入到98 mL的STEMdiff™ Cerebral Organoid Basal Medium 2中。 使用5 mL或10 mL的移液管，轻轻的吸除培养孔中的培养基。不要碰到Matrigel®包埋的类器官。 每孔更换3 mL新鲜的Maturation Medium。 将含有类器官的培养板置于37°C孵箱的水平摇床上。INFORS HT Celltron orbital shaker，按照表1调整转速（rpm）。对于其它摇床型号，请使用以下公式计算转速。
表1. INFORS HT Celltron Orbital Shaker的推荐摇床速度，适用于各种培养器皿 
*我们推荐使用6孔板或12孔板。
†Calculated using throw (shaking diameter) of 25 mm for the INFORS HT Celltron.
其中： rpm=转速（每分钟转数） RCF=相对离心力(g)，表2中提供了各种培养器皿的相对离心力。 throw = shaking diameter (mm), as specified by manufacturer 每隔3 - 4天进行一次全换液，具体如下： a.倾斜培养器皿。 b.使用5 mL移液管慢慢吸除培养基。 c.加入3 mL/孔的新鲜培养基。 d.将培养板置于37°C孵箱的水平摇床上。 在Maturation Medium中培养30天后，类器官会长到3 - 4 mm的大小。 第10天：器官显示萌芽形态，说明神经上皮的扩张。 第15天：扩张的神经上皮出芽合并，类器官形成一个致密的中心。 第20天：类器官的直径将超过750 μm；可观察到小的神经花环状结构。 第30天：类器官直径超过1 mm，并显示出带有致密中心的组织结构。 第40天：类器官的直径约为3 - 5 mm。这时，类器官中心部位致密且深，并具有皮层细胞的分布。发育不好的类器官没有形成清晰的边界、大小上在培养至40天时也会小于1 mm。PAX-6 的祖细胞被发现位于脑室带样区域存在，并且明显与TUJ-1 的神经元分开。 40天后，可使用STEMdiff™脑类器官成熟试剂盒（产品号 ＃08571）继续培养脑类器官。
参考文献
1. Lancaster et al. (2013) Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501(7467): 373–9.
2. Lancaster et al. (2014) Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science 345(6194): 1247125.