蛋白定量：BCA法丨Bradford法详情应用攻略

蛋白定量BCA法，Bradford法，是2种常见的蛋白定量方法，关于这两种方法的原理，优缺点，以及操作步骤，下面将一一解析。

一、蛋白定量BCA（Bicinchoninic Acid）法

BCA (bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，562nm处有zui高的吸收值，可在540-595nm测定其吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

特点：灵敏度高，操作简单，正常情况下可在45分钟内完成测定；且试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。需要注意的是这种方法需要提前制作标准曲线。Abbkine定量总蛋白的蛋白质定量试剂盒（BCA法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，zui低检测蛋白量达到5ug。

实验所需仪器及试剂：恒温水浴锅、可见光分光光度计、离心机、旋涡混合器、试管

操作步骤：

1.标准液制备：梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品。将8个EP管按照1到8进行标记，将BSA标准品稀释成1mg/mL工作液，准备浓度梯0，50，100，200，400，600，800，1000 ug/mL。

2.BCA工作液制备：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液，充分混匀。（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）

3.加样孵育：吸取20μL各个稀释浓度的蛋白质标准品或待测蛋白质样品，加入96孔板底部或试管中，向孔/管中再加入200uL BCA工作液轻轻摇晃混匀。在37°C下孵育30min，冷却至室温。

4.测定：冷却到室温后，以空白为对照，测量样品在562nm或该波长附近的吸光值

5.将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。

浓度计算：

1.在excel表中输入对应的标准曲线值和蛋白样品值。（图中所示均为举例说明），选定标准曲线的OD值和标准品蛋白浓度。

2.点击excel表栏：插入-图表-XY散点图，并点击确定。

3.点击确定后会自动生成XY散点图，随意点击散点图中的任一的散点，右键添加趋势曲线。

4.点击趋势线的拓展栏，选择“更多选项”

5.选择“更多选项”，弹出“设置趋势图格式”的画面，点击“显示公式（E）”以及“显示R平方值”。一般R2值越接近1，表现标准曲线做得越好，根据标准曲线带入的样品OD值测出的蛋白浓度也越准确，一般要求为0.99几左右。

6.将样品OD值代入标准曲线的公式中，计算即得到待测样品蛋白的浓度。

考马斯亮蓝法（Bradford）

Bradford法也称作考马斯亮蓝法，是由Bradford于1976年建立的。该方法的原理是，带负电的考马斯亮蓝染料与蛋白质中碱性氨基酸相互作用。

特点：简单便捷、灵敏度高，Abbkine蛋白质定量试剂盒（Bradford法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，zui低检测蛋白量达到5ug。反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量。Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，如：K+ 、Na+ 、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP 和β-巯基乙醇等。

需要注意的是：由于高浓度洗涤剂会影响检测结果的可靠性，必须确保样品中的SDS的浓度低于1％，Triton X-100低于0.1％，Tween 20,60,80低于0.06％，以及检测蛋白浓度的考马斯亮蓝和染色PAGE胶的考马斯亮蓝不是同一种物质，前者采用考马斯亮蓝G250，后者采用考马斯亮蓝R250，G250和R250分子基本骨架一样，但是G250多了两个甲基，与蛋白反应迅速，染胶慢且脱色困难，故用于蛋白定量；R250与蛋白反应较缓慢，染胶较快且易于洗脱，故用于PAGE胶染色。

以上两种蛋白定量方法：BCA蛋白质定量法&Bradford蛋白质定量法的使用场景，应该根据实验条件来选择，这样实验数据才会更可靠~