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一 研究背景
氧化应激与阿尔茨海默氏病（AD）的发病机理有关。而线粒体功能障碍与阿尔茨海默氏病（AD）神经毒性的氧化应激和活性氧（ROS）有关。线粒体代谢受损与AD脑损害的线粒体功能障碍有关。星形胶质细胞是中枢神经系统(CNS)胶质细胞中最多的亚型，其作用与大脑发育及其功能有关，如突触的形成和功能发挥、神经递质释放与摄取、营养因子的产生和神经元存活的控制。受损星形胶质细胞支持功能的丧失与导致神经退行性疾病的神经元死亡有关。线粒体由5个蛋白质复合物组成整合到线粒体内膜，包括复合物I (NADH:泛醌氧化还原酶)、复合物II(琥珀酸脱氢酶)、复合物III(辅酶Q:细胞色素c还原酶)、复合物IV(细胞色素c氧化酶)和复合物V (ATP合酶)。其中主要是复合体I和复合体III活性障碍导致活性氧产生增加。星形胶质细胞中的线粒体代谢在脑生物能、神经传递和氧化还原平衡中起重要作用。在生理或病理条件下，线粒体代谢对星形胶质细胞氧化还原的调节至关重要。在线粒体代谢途径中，线粒体呼吸和电子传递链（ETC）氧化磷酸化，三磷酸腺苷产生中起着关键作用。
铁死亡是一种程序性细胞死亡，依赖于铁和脂质过氧化物(主要是脂质氢过氧化物)的积累，脂质氢过氧化物通过膜脂质加速氧化对脂质双分子层造成损害。活性氧过度产生和脂质过氧化的激活与铁死亡依赖性细胞死亡有关。线粒体损伤已被发现与神经退行性疾病，如AD和PD，脂质过氧化和铁稳态失衡有关[34]。NADPH氧化酶(NOXs)是一类产生ROS的多亚基膜结合酶家族，将NADPH作为电子供体和氧作为电子受体来催化氧还原成超氧化物。在NOX亚型中，NOX4是星形胶质细胞的主要亚型，其促进ROS生成。已经明确导致脑损害的ROS主要来源NADPH氧化酶4（NOX4），但NOX4调节AD中星形胶质细胞铁死亡的具体机制尚不清楚。研究者通过免疫荧光染色检查AD患者和APP/PS1双转基因AD模型小鼠的大脑皮质中，受损的星形胶质细胞NOX4蛋白水平，脂质过氧化的标志物4-羟壬醛（4-HNE）和丙二醛（MDA）的水平；通过上调NOX4抑制线粒体呼吸和ATP生产探讨氧化应激诱导AD患者星形胶质细胞死亡的分子机制。
二 研究结果
1 AD患者皮质区域受损的星形胶质细胞NOX4的水平升高
为了探讨NOX4在AD患者星形胶质细胞损伤中的作用，通过免疫荧光染色分析AD患者和非AD者(正常)大脑颞叶皮质组织中GFAP阳性星形胶质细胞中NOX4的蛋白水平(图1A和B)。结果显示，与非AD者(正常组)相比，AD患者皮质区NOX4和GFAP阳性共定位的受损星形胶质细胞数量显著增加(图1C)；星胶质细胞形状缩小，纤维长度缩短(图1A)。在GFAP受损星胶质细胞中，AD患者NOX4阳性染色强度增加(图1A和图S1)，且均高于非AD者(正常)。表明阿尔茨海默病患者受损星形胶质细胞中NOX4蛋白水平升高。
补充图S1
2 在AD患者皮质区域受损的星形胶质细胞中氧化应激诱导的脂质过氧化水平升高
为探讨NOX4在AD患者受损星形胶质细胞发生氧化应激中的作用。通过免疫荧光染色检测AD患者和非AD者(正常)大脑颞叶皮质受损星形胶质细胞的脂质过氧化水平是否升高。4-HNE是氧化应激诱导的脂质过氧化和细胞毒性的标志物。结果显示，与正常对照组(非AD者)相比，AD患者(AD)皮质区分子层（ML） 4-HNE和GFAP共定位阳性的星形胶质细胞数量显著增加(图2C)；且GFAP阳性星形胶质细胞的4-HNE阳性染色强度增加(图2A/B和图S2)。与上述结果一致，脂质过氧化终产物MDA在GFAP阳性星形胶质细胞中染色阳性（图S3）；且MDA与GFAP阳性共定位的星形胶质细胞的数量和阳性染色强度均高于非AD供者(正常)(P<0.01)。且AD患者4-HNE和MDA水平普遍较高。此外，比较AD患者与对照组中，4-HNE和NOX4共定位的星形胶质细胞数量(图2D和图S4)。AD患者共定位阳性的星形胶质细胞数量明显高于正常对照组(图2E)。这些结果提示阿尔茨海默病患者受损的星形胶质细胞氧化应激诱导的脂质过氧化水平升高。
图2
补充图S2
补充图S3
补充图S4
3 APP/PS1小鼠大脑皮质受损星形胶质细胞中NOX4水平升高
接下来，研究者检测了NOX4在APP / PS1双转基因AD模型小鼠的受损星形胶质细胞中的作用。通过免疫荧光染色分析App / PS1小鼠或野生型（WT）小鼠脑皮质星形胶质细胞中NOx4蛋白质水平（图3A和图S5）。结果表明，与WT小鼠相比，APP / PS1小鼠的皮质区域GFAP阳性星形胶质细胞中NOx4阳性染色的强度增加（图3A和B）；且NOx4和GFAP阳性共定位的星形胶质细胞数量显着增加（图3C）。这些结果表明APP / PS1小鼠胶质细胞中NOx4的蛋白质水平升高。
图3
补充图S5
4 在APP/PS1小鼠大脑皮层受损星形胶质细胞中氧化应激诱导的脂质过氧化水平升高
接下来，研究者检测了APP/PS1小鼠受损星胶质细胞中NOX4源性氧化应激作用。我们分析在APP / PS1小鼠脑皮质受损星胶质细胞中氧化应激诱导的脂质过氧化物水平是否升高。免疫荧光染色显示，与WT小鼠相比，APP / PS1小鼠的皮质区的4-H内阳性染色强度增加（图4A/C和图S6）。此外，相对于WT小鼠，APP/PS1小鼠中4-HNE和GFAP同定位阳性的星形胶质细胞数量显着增加（图4D）。相一致地，GFAP阳性星形胶质细胞中MDA染色阳性的强度（图4B/E和图S6）;且MDA和GFAP共定位阳性的星形胶质细胞数量（图4F ）。此外，APP / PS1小鼠4-HNE和NOx4共定位阳性的星形胶质细胞数量（图4H）和染色强度（图4G和图S7）显著增加。这些结果表明，APP/PS1小鼠受损星胶质细胞中氧化应激诱导的脂质过氧化水平升高。
补充图S6
补充图S7
5 NOX4升高通过抑制人星形胶质细胞的线粒体呼吸和ATP产生破坏线粒体代谢导致氧化应激
为研究在AD患者星形胶质细胞中NOx4诱导氧化应激的潜在分子机制，探讨NOX4是否通过的线粒体功能障碍促进氧化应激。通过分析NOX4升高对人星形胶质细胞线粒体代谢活性的影响，例如线粒体呼吸和电子传输链（ETC）活性以及ATP生产。首先，作者量化氧气消耗，通过依次加入oligomycin （线粒体呼吸选择性抑制剂）、FCCP （线粒体氧化磷酸化的强效解耦剂）、 rotenone 和 antimycin（线粒体复合物I和III的特异性抑制剂）测定OCR作为线粒体呼吸活动的参数。与对照组相比，NOx4过表达后OCR的基础水平显著受抑制，且oligomycin 和 FCCP给药组 OCR水平明显降低（图5A和B）。接下来，研究了人星形胶质细胞NOx4过表达调节线粒体呼吸道途径的分子靶标。通过分析线粒体呼吸和氧化磷酸化中五种蛋白复合物的关键酶水平，分别是NADH：泛醌氧化酶亚单位B8（NDUFB8），用于复合I；琥珀酸脱氢酶复合铁硫磺亚基B（SDHB），用于复合II；泛醌-细胞色素C还原酶核心蛋白2（UQCRC2）对于复合III；线粒体编码的细胞色素C氧化酶I（MTCO1），用于复合IV；ATP合酶F1亚基α（ATP5F1A），用于复合V（图5C和图S8）。
图5
图S8
与OCR水平一致，NOx4过表达组中五种线粒体氧化磷酸化酶复合物的蛋白质水平明显降低。相对于对照组，NOx4过表达ATP显着降低（图5D）。通过分析NOx4升高导致的线粒体代谢损伤是否可以诱导人星胶质细胞的氧化应激。通过分析NOX4过表达的人星胶质细胞中线粒体形态改变和活性氧（mtROS）生成水平。与对照相比，NOx4过表达mtROS显着增加（图5E）。通过线粒体外膜蛋白标志物Tomm20进行免疫荧光染色发现，与对照组相比，NOx4过表达导致线粒体破碎（图5F）且碎裂线粒体的细胞数量显着增加（图5G） 。这些结果表明在人星形胶质细胞中NOX4升高促进氧化应激，其机制是通过抑制线粒体呼吸和ATP产生损坏线粒体代谢。6 NOX4诱导的线粒体代谢损伤通过抑制人星形胶质细胞的细胞抗氧化过程诱导氧化应激
为研究NOx4诱导人星形胶质细胞线粒体代谢损伤是否可以通过抑制细胞抗氧化过程来诱导氧化应激。将谷胱甘肽（GSH）水平和GSH/GSSG比值降低比例作为氧化应激的指标。NOX4升高显着降低谷胱甘肽（GSH）的水平和GSH /氧化谷胱甘肽（GSSG）的比例（图6A和B）。同时，与对照相比，NOx4升高导致GSSG水平增高（图6C）。由于NOX4导致GSH和GSH/GSSG的比率降低，因此我们接下来检查NOx4是否可以影响人星形胶质细胞抗氧化反应的关键调节器——核红相关因子2（NRF2）信号通路。与对照相比，NOx4升高抑制了NRF2核转移（图6D）。此外，在人星形胶质细胞中过表达NOX4 ，作为NRF2靶基因的血红素氧和酶1（HO-1）和谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCL）的活性水平显著降低）（图6E/F）。这些结果表明人星形胶质细胞中NOX4诱导的线粒体代谢损伤是通过抑制细胞抗氧化途径诱导氧化应激。
图6
图S9
7. NOX4通过氧化应激诱导人星形胶质细胞脂质过氧化作用促进铁死亡
为探讨氧化应激诱导AD患者星形胶质细胞死亡的分子机制，我们检测人星形胶质细胞过表达NOX4促进铁死亡是否通过氧化应激诱导脂质过氧化。由于AD患者受损星形胶质细胞中铁死亡标记物4-HNE水平升高，我们分析人星形胶质细胞中NOX4过表达引起的脂质过氧化和形态学损伤的变化。通过免疫荧光染色法测定人星形胶质细胞4-HNE蛋白水平。免疫荧光染色显示，与对照相比， NOx4过表达的人星胶质细胞膜收缩且过氧化形成的脂滴增加（图7A）；4-HNE阳性细胞的数量（图7B） ；4-HNE蛋白水平升高（图7C和S10）；MDA水平增加（图7C和图S10）。此外，与对照相比，NOx4过表达后，铁死亡的特定标志物铁的积累增加（图7D）。与4-HNE的水平一致，NOx4过表达诱导细胞形态毒性样改变，包括细胞质收缩（图7E）；且死细胞的数量显着增加（图7F）。与形态学分析的结果一致，NOx4过表达显着增加了细胞毒性（图7G）。这些结果表明NOX4通过氧化应激诱导人星形胶质细胞脂质过氧化促进铁死亡。
图7
图S10
三 结论
在人星形胶质细胞中，NOX4过表达导致线粒体代谢受损，其机制是通过抑制线粒体的五种蛋白质复合物ETC导致线粒体呼吸和ATP产生。此外，NOX4过表达会诱导氧化应激，主要通过线粒体ROS（mtROS）的产生，线粒体的片段化以及抑制胞内抗氧化反应。总之，我们的研究表明， NOx4通过氧化应激诱导脂质过氧化，促进星形胶质细胞发生铁死亡作为AD患者星形胶质细胞线粒体代谢障碍的重要分子机制。
