重磅综述 | Nature Reviews Nephrology：使用单细胞技术绘制人体免疫系统图谱-对肾脏病学的意义
编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
单细胞技术的进步正在改变我们对细胞身份的理解。例如，单细胞RNA测序和质谱分析技术在研究血液、次级淋巴器官和肾中免疫细胞群的应用中，可以帮助研究人员绘制肾脏内复杂的免疫细胞图谱，定义细胞个体发育并了解肾脏驻留免疫细胞与循环系统中的对应细胞之间的关系。这些研究还为健康细胞以及一系列肾脏疾病和癌症中免疫细胞群与邻近的上皮和内皮细胞之间的相互作用提供了见解。这些数据具有翻译潜力，将有助于识别药物靶标并能够更好地预测脱靶效应。将单细胞技术应用于临床肾脏活检样本甚至尿液中的细胞，将提高诊断准确性，并有助于各种肾脏疾病患者的个性化预后。健康个体和影响肾脏的全身性自身免疫性疾病患者外周血和继发性淋巴器官的免疫细胞类型的比较，也将有助于了解自身免疫力和自我免疫应答传播减弱的机制。这些免疫细胞图谱具有改变肾脏病学的潜力。
论文ID
原名：Usingsingle-cell technologies to map the human immune system-implications fornephrology
译名：使用单细胞技术绘制人体免疫系统图谱-对肾脏病学的意义
期刊：Nature Reviews Nephrology
IF：19.684
发表时间：2019.12
通讯作者：Menna R.Clatworthy
通讯作者单位：英国剑桥NIHR生物医学研究中心
DOI号：10.1038/s41581-019-0227-3
综述内容
单细胞技术
免疫系统已经进化为可以抵抗微生物病原体，但是也可以对组织损伤和经历了恶性转化的细胞做出反应。它包括一个先天性的和适应性的系统，每个系统都有细胞和可溶性成分。先天性的提供了立即反应，一系列细胞类型起着前哨作用，并在整个人体组织中分布着快速的效应因子。这些细胞包括树突状细胞（DC）、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和一系列先天性淋巴细胞，不仅在防御中而且在组织稳态和修复中都具有关键作用。免疫系统的适应性需要时间来发育，并且在抗原识别后会产生高度特异性的反应。这些应答的核心是极为多样化的B和T淋巴细胞受体，在B细胞受体的情况下，可以在免疫应答过程中对抗原产生更高的亲和力。适应性免疫反应发生在专门的次级淋巴器官（即脾、扁桃体和淋巴结）的网络中，需要免疫细胞从血液和淋巴中迁移到这些组织结构中（图1）。
图1 循环系统、次级淋巴器官和非淋巴器官中的免疫细胞定位。
免疫学家最早了解这种复杂系统的工作通过其形态特征对不同免疫细胞亚群进行分类，并且随着技术的发展，它们可以表达不同的分子标记基因。然后，根据影像学研究以及体外和体内干扰研究（经常使用小鼠作为模型），为这些表型和分子定义的细胞亚群分配特定的功能和解剖位置。流式细胞术是最简单的单细胞技术，已经使用了几十年，以极高的通量测量单个细胞上的少量标记基因（通常少于15个）来评估免疫细胞的分子组成。在单细胞转录组学技术广泛应用之前，免疫细胞的转录组学研究很大程度上依赖于使用基因微阵列或RNA-seq，或着通过流式细胞仪、磁珠或密度梯度离心分离。过去十年来，随着单细胞技术的发展，科研人员以无标记、无偏见的方式评估免疫细胞异质性和功能。此类方法可生成高维数据，从而使细胞能够得到大量标记基因的表达（质谱分析中>40）或转录标记基因（通过scRNA-seq）或染色质可及性图谱（通过scATAC-seq）。新兴的单细胞技术可以并行发现多种生物学信息，例如，同时进行高水平的转录本和蛋白质丰度检测，或同时检测转录本的丰度和DNA序列或染色质可及性。这些方法可以了解调节相互作用，并能对细胞类型和状态进行数据丰富的定义。
大约5年前，scRNA-seq实验开始探测组织的细胞成分。这些使用细胞分选和基于液滴微流控方法的研究可以描绘出不同转录的小鼠脾脏免疫细胞群，并描绘出脂多糖诱导的转录变化，强调了这项技术表征小鼠肺上皮细胞谱系随时间发育的能力。液滴微流控技术的发展和细胞条形码技术能够以无偏见的方式解析发育和成熟的心鼠组织的细胞种群结构。在过去的几年中，这些方法为大规模生产scRNA-seq数据铺平了道路，这些实验能够生成包含超过100000个细胞的人类和小鼠组织的细胞图谱的大规模数据集。目前可用的scRNA-seq方法使得能够使用多孔板或微流控技术对单个细胞或核RNA进行分离和分析（图2），并已在其他综述中进行了深入描述。
除了在整个scRNA-seq方法中提供更高的便利性之外，技术进步还允许同时对单细胞表面蛋白和细胞转录组进行检测，例如CITE-seq或REAP-seq。这些方法以流式细胞术类似的方式用抗体标记细胞；但是，抗体是用DNA条码而不是荧光基团标记的。与目标细胞中的RNA同时捕获该DNA条码，在逆转录步骤之后将其分离，并用于制备单独的细胞表面蛋白特异性文库。与抗体的DNA条形码一起被捕获，该条形码唯一地标识每个细胞，从而能够对细胞表面蛋白表达进行单细胞定量。与流式细胞术相比，该技术的主要优势在于它可以测量大量蛋白质。在流式细胞仪中，荧光基团的光谱重叠将标记物的数量限制在15种左右。大规模的细胞学实验受到同位素可用性的限制，限制在40种左右。但是，由8个碱基对组成的DNA条码最多可产生65536个独特的组合，理论上可以测量数千种蛋白质。迄今为止，在单个实验中已测量了约一百种蛋白质，而目前的经验表明，结合评估表面蛋白质和细胞转录组数据可以提高细胞聚类。未来的进展应该可以看到条形码表位的发展，以便能够研究抗原特异性B和T细胞。
这些高通量方法通常需要同时使用物理分解法和酶消化法将组织样品解离为单细胞悬液。这种方法有许多缺点。首先，解离过程可以改变细胞的转录组和蛋白质组，例如，通过上调应激反应的编码热激蛋白的基因。第二，器官的解离导致细胞的空间排列及其解剖定位有关的信息丢失。例如，肾脏的皮质和延髓包含肾单位的不同部分，并具有不同的组织环境，延髓为驻留的免疫细胞提供了高盐和低氧环境。因此，必须考虑单细胞转录组研究中每个细胞的精确解剖位置，以充分了解局部组织环境的影响。在单细胞分析中，可以使用两种广泛的方法来结合空间和转录信息（图2）。首先是使用空间转录组方法将细胞条形码与细胞的空间位置联系起来，或者可以使用共聚焦显微镜结合RNA探针来识别组织切片上的转录本。
图2 单细胞测序技术。
除了空间和高通量方法学的发展外，还可以看到功能强大且可扩展的计算方法的快速发展，从而能够分析由大规模细胞计数法和scRNA-seq实验生成的大型单细胞数据集。这些方法包括对数据进行聚类、计算重建发育轨迹和推断细胞间分子网络的工具。还开发了整合不同实验批次或使用不同方法生成的单细胞转录组数据集分析的方法。此类方法将通过消除技术批次效应来实现细胞类型的比对，并允许对不同实验条件和生物学重复进行比较。
免疫学家已迅速将中高通量的scRNA-seq方法应用于人类样本，以解决有关免疫细胞异质性、个体发育、细胞极化和细胞命运的问题，并鉴定罕见的以前未鉴定的细胞亚群。尽管这些实验集中于循环系统中最容易获得的免疫细胞，但现在组织处理的改善使研究人员能够将其研究范围扩大到相对稀少的组织驻留免疫细胞，以及发育和疾病状态。在以下各节中，研究者将讨论使用单细胞技术定义跨不同细胞区室的免疫细胞的研究，重点是人体研究。这些实验说明了这些方法在解决有关免疫系统及其在肾脏动态平衡和疾病中的作用的特定问题的潜力。
外周血中的免疫细胞图谱
外周血代表了人类中最容易接近的免疫区域。除T淋巴细胞外，大多数免疫细胞都在骨髓中发育，一旦成熟便迁移到循环系统中。因此，血液提供了整个生物体免疫状态但不完整的图谱。如以下各节所述，将单细胞技术应用于研究外周血白细胞有可能为免疫细胞生物学提供许多见解（图3）。此外，由于许多肾脏疾病是由全身免疫细胞群的扰动引起的，更好的循环免疫细胞概况分析可能有助于疾病的诊断和预后，提高对疾病机制的了解并促进疾病活动生物标记基因的发展。
图3 外周血中的免疫细胞图谱。
血液图谱
在scRNA-seq出现之前，循环细胞亚群中异质性的研究，依赖于使用已知的标记基因来鉴定和分析细胞频率、细胞转录本和细胞功能。scRNA-seq方法使研究人员能够以无偏见的方式分析循环细胞，这种方法改善了人们对循环细胞异质性和相互关系的理解。一个例子是进行68000个PBMC的scRNA-seq描绘外周血中淋巴样和髓样细胞群体的整体结构的研究，强调了这种方法表征罕见细胞亚群的能力，并提供了与疾病状态进行比较的有用的参考数据集。
新的细胞类型的鉴定
除了以无偏见的方式分析大量细胞的能力以外，scRNA-seq还可以了解循环系统的细胞异质性，并鉴定新的细胞亚群（图3a）。如果新的细胞亚群很少见，则可能需要使用已知标记基因预先富集感兴趣的特定免疫细胞群，以确保有合理数量的细胞用于分析。一旦富集，scRNA-seq可应用于此类细胞群体并评估是否存在其他多样性，或者实际是否存在稀有的新型免疫细胞亚群。目前，在这方面的许多努力都集中在常规的DC细胞（cDC）上，它们是重要的抗原呈递细胞（APC），它们在通过激活CD4+ T细胞启动适应性免疫应答中起关键作用。cDC拥有两个主要细胞子集：cDC1表达CLEC9A和CD141并交叉呈递抗原，而cDC2表达CD1c并起经典APC的作用。一项针对2400种分选的单核吞噬细胞（MNP）scRNA-seq研究，包括单核细胞、cDC和浆细胞样DC（pDC），可以更好地了解cDC的异质性而不依赖于表面标记基因的表达，发现了与已报道的cDC2和cDC1相对应的DC细胞子集，以及cDC2细胞的其他炎症细胞群体。这种方法使研究人员能够将pDC与表达AXL和SIGLEC6的新型DC区分开来。这些DC在功能和形态上与pDC有所不同，强调了单细胞技术识别罕见的新型免疫细胞亚群的能力。
细胞前体的表征
通过评估骨髓中未成熟免疫细胞和血液中成熟免疫细胞之间的转录相似性，以及绘制发育阶段之间的转录轨迹来确定免疫细胞前体（图3b）。在这种情况下，大多数使用scRNA-seq的研究都试图表征cDC的前体（pre-cDC）。cDCs来自骨髓来源的祖细胞，即常见的DC祖细胞，该细胞分化为pre-cDC，它是cDC的直接前体。通过对外周血和脐带血中分离的cDC1和cDC2进行scRNA-seq测序，研究pre-cDC是否已经极化到cDC1或cDC2命运时发现，pre-cDC由两个不同的细胞前体群体组成，未来发育成为cDC1或cDC2。另一项研究通过流式细胞术分选的cDC的scRNA-seq，在成人外周血中发现了一种罕见的cDC祖细胞，并认为可以产生pre-DC1和pre-DC2。另一项研究进一步完善了循环DC前体的性质，该研究结合了细胞计数法（CyTOF）和scRNA-seq并通过标记CD123、CD33和CD45RA鉴定人血DC前体。这些pre-DC与pDC共享表面标记基因，并具有不同的功能特性。此外，追踪DCs从骨髓到外周血的分化鉴定出pre-DC不同谱系的亚群。
离体干扰研究
众所周知是，特定亚群内的免疫细胞对刺激的反应不同。单细胞技术是理想的工具，可以用来描述这种异质响应的基础机制（图3c）。例如，可以像在脂多糖刺激的鼠脾细胞研究中所做的那样，在单个细胞中分析响应刺激而发生的转录变化。一种更先进的方法是使用创新的基于液滴的微流控平台，该平台将单细胞细胞因子分析与scRNA-seq分析相结合，以研究人外周血来源的pDC响应Toll样受体配体的刺激而产生I型干扰素。通过调节微滴的微环境，研究人员表明，I型干扰素的产生仅限于单个刺激的pDC的一小部分亚群，并且该功能受随机基因调控的控制。实际上，pDC细胞因子反应是由细胞自主I型干扰素扩增环驱动的。
细胞功能的理解
早期研究全身性自身免疫性疾病（包括那些影响肾脏的疾病）患者免疫细胞功能障碍的性质和机制的尝试，主要涉及大量PBMC的转录谱分析。这些研究为免疫细胞功能障碍时发生的分子变化提供了一些见解，例如，SLE患者的I型干扰素信号的鉴定。通过使用流式细胞仪分离细胞群体后，对群体进行概要分析，可以进一步深入了解介导与疾病相关的转录变化的确切细胞亚群。例如，一项2015年的研究表明，CD8+ T细胞衰竭的特征可识别出多种自身免疫疾病的预后较好且复发率较低的患者。这些研究通常包括数百个病例和对照，由于技术的费用，这种数量规模的外周血样本不适于scRNA-seq研究。但是，随着成本下降和通量增加，对患者和健康对照者的外周血样本进行scRNA-seq研究将变得可行，并有可能进一步解决病原性细胞亚群和信号通路（图3d）。
目前已经朝着这个方向迈出了第一步。例如，对PBMC的高通量scRNA-seq研究利用了转录组学数据中存在的序列变异，可以在异体骨髓移植之前和之后在骨髓单核细胞之间区分宿主衍生细胞和供体衍生细胞。这个例子强调了这种方法在干细胞和骨髓移植或实体器官移植的背景下提高我们对宿主和供体来源细胞命运的理解。
次级淋巴器官的免疫细胞
次级淋巴器官代表产生适应性免疫反应的位点。这个过程需要B和T淋巴细胞和APC的动态空间精确定位，这种动态定位是由淋巴结和脾脏内的基质细胞来协调的。尽管在小鼠中的研究表明，这些技术可用于追踪抗原特异性B和T细胞克隆，但在人类次级淋巴器官中的高维单细胞研究却很少；可以研究不循环的免疫细胞亚群，但仅限于外周器官和次级淋巴组织；并探究淋巴结免疫区和基质区之间的相互作用（图4）。
图4 淋巴器官中的免疫细胞图谱。
抗原特异性淋巴细胞克隆
B和T淋巴细胞受体对于产生适应性免疫反应至关重要。编码这些受体的抗原识别结构域的基因组区域在称为V（D）J重组的过程中经历了广泛的重组事件，以生成种类繁多的特异性结合自身抗原和非自身抗原的受体。在适应性免疫应答的过程中，抗原特异性淋巴细胞的选择和增殖可确保该应答具有强大性和特异性。在免疫应答过程中，B细胞受体及其分泌的抗体的抗原亲和力增强，从而进一步完善了抗体应答的特异性。单细胞水平的克隆多样性可通过RNA-seq（图4a）进行评估，并已被用于小鼠模型中追踪沙门氏菌和疟疾感染整个过程中不同T淋巴细胞克隆的命运。这些方法也为研究免疫系统发育赢得了关注。例如，人类胎儿肠道中的T记忆淋巴细胞与其初始细胞相比，显示出克隆扩增，表明存在组织驻留适应性免疫体系结构。这些技术的进一步应用可能有助于我们了解免疫发育、体内稳态、感染以及同种异体移植耐受和排斥的背景下组织驻留淋巴细胞的克隆情况。
非循环免疫细胞测序分析
一些免疫细胞亚群以极少数的形式存在于循环或非循环系统中，残留在组织或次级淋巴器官中。因此，直接研究次级淋巴器官可以更好地了解这些细胞生物学特性（图4b）。这些非循环免疫细胞包括在淋巴结和脾脏内具有特定功能的常驻巨噬细胞子集，例如淋巴结荚膜下囊窦巨噬细胞，脾红髓巨噬细胞和边缘区巨噬细胞。另外，许多先天淋巴细胞在循环系统中的存在非常有限，这促使研究者将精力集中在淋巴器官上。一项研究绘制了自然杀手（NK）细胞和三个非细胞毒性先天性淋巴样细胞（ILC）亚群的转录谱，这些分选的淋巴细胞表达CD127但不表达人类扁桃体的抗原特异性T细胞受体，并证明了ILC3s之间存在异质性。另一项将scRNA-seq应用于脾脏和血液NK细胞的研究，报道了小鼠和人类的血液和脾脏NK细胞群体内的大量转录异质性，发现了两个广泛的NK细胞亚群，它们在各个器官和物种中均是保守的。这些NK种群表现出不同的功能特征，其中NK1细胞表现出丰富的细胞毒性特征，而NK2细胞表现出丰富的趋化因子表达特征，表达了保守的DC趋化因子基因XCL1。
免疫-基质细胞相互作用
淋巴结和脾脏中的基质细胞在将免疫细胞组织成特定的微生态中起着至关重要的作用，以实现有效免疫反应所需的顺序免疫细胞的相互作用。滤泡DC和边缘网状细胞可协调B细胞在滤泡中的定位，滤泡DC和边缘网状细胞是产生B细胞吸引趋化因子（如CXCL13）和细胞因子（如B细胞激活因子BAFF）的基质细胞亚群，可促进B细胞存活。在T细胞区，表达CCL21和CCL19的基质细胞（称为T区网状细胞TRC）吸引表达CCR7的淋巴细胞。一项使用基于液滴的scRNA-seq研究，在稳态条件下和病毒攻击后分选CD45和CD31双阴性小鼠淋巴结基质细胞，鉴定出九个基质细胞簇，包括已知的细胞簇，但也包括几个新的细胞簇。研究人员特别指出，TRC内部存在异质性，CCL19low TRC位于T细胞区域周边，CXCL9+TRC位于T细胞区域和卵泡间区域，包膜和髓质血管中有表达CD34的基质细胞，髓索中有吲哚乙胺N-甲基转移酶阳性基质细胞，以及分布更广泛的Nr4a1阳性基质细胞群。他们的工作进一步完善了我们对淋巴结内基质细胞的理解，并表明即使处于体内稳态某些细胞亚群似乎处于激活状态（图4b）。将这些研究扩展到人淋巴结和脾脏，将改善我们对如何促进或抑制适应性免疫反应的理解，尤其是有助于自身免疫或同种免疫反应。
非淋巴器官中的免疫细胞
所有器官，包括肾脏，都包含一个免疫细胞网络，介导对受损组织和微生物攻击的反应，并有助于维持器官的稳态。研究者从小鼠的研究中获得了许多关于组织驻留免疫细胞的见解。由于新鲜组织样本的可获得性有限，对人类组织驻留免疫细胞的了解还很少。相对于上皮和内皮中的组织驻留免疫细胞数量少，这带来了另一个挑战。因此，检测大块组织样本的转录组的研究很可能会错过重要的免疫细胞特异性转录特征，因为这些特征主要是由大量上皮细胞获得的强信号所介导的。scRNA-seq可以解决这个问题。小鼠中的研究表明，与环境接触的非免疫器官，例如肠道和皮肤，也可能有助于病原体感应和组织防御。此外，在肾脏上观察到，上皮细胞与免疫细胞之间也会发生交流，例如，通过趋化因子的产生来了解免疫细胞的特定解剖位置。确实，局部免疫反应和随后的组织修复是免疫细胞与非免疫细胞之间协同相互作用的结果。对器官（例如在稳态条件下的肾脏）进行scRNA-seq研究，有可能揭示非淋巴器官内免疫细胞群的真正异质性，有助于我们了解免疫细胞的存在，以及对组织环境和免疫细胞的适应性与器官环境中非免疫细胞的相互作用（图5）。
图5 肾脏中的免疫细胞图谱。
免疫细胞异质性
人体器官中免疫细胞的研究通常依赖于将显微镜应用于活检或尸检样品。但是，这种方法在评估样品中免疫细胞异质性的能力上受到可同时评估的标记数量（一般小于4）的限制。显微镜检查还依赖于特异性抗体对于结合固定组织切片的已知免疫细胞标记物。这种局限性导致对人体器官内免疫细胞亚群异质性的认识不完全。scRNA-seq具有对组织内免疫细胞进行公正评估的潜力，但可能需要预选择步骤，例如使用微流分选、磁珠选择或密度梯度离心来富集样品中的稀有细胞群（图5a）。
2019年对人肺的一项研究提供了该技术在器官内生成完整免疫细胞图谱。通过对气管不同部位的活检样品进行scRNA-seq，研究人员鉴定出嗜中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、DC、NK细胞、B和T淋巴细胞，以及具有循环记忆细胞和组织驻留记忆细胞特征的新型迁徙CD4+ T细胞亚群。该研究还证实了肺离子细胞的存在，肺离子细胞是scRNA-seq研究鉴定出的肺上皮细胞群体，独特表达囊性纤维化跨膜介导调节（CFTR）基因（即在囊性纤维化中突变的基因）。现在认为这小部分细胞代表了气管上皮中生理CFTR活性的主要来源，对囊性纤维化研究具有重要意义。
同样，对五种健康的人类肝脏样本的8444个细胞进行了测序，鉴定出20种离散的肝细胞、内皮细胞、胆管细胞、肝星状细胞、B细胞、浆细胞、常规αβ CD4+和CD8+ T细胞、γδ T细胞、NK样细胞和不同的肝内MNP细胞。后者包括两个表达CD68的巨噬细胞群，一个具有更强的促炎性，另一个具有更强的耐受性。
这些研究共同说明了scRNA-seq在描述健康组织中免疫细胞异质性方面的潜力，并提供了一个平台来研究这些细胞如何促进器官体内稳态以及它们如何改变疾病。
免疫细胞发育
在小鼠中，组织巨噬细胞可以起源于卵黄囊或胎儿肝祖细胞，这些卵黄囊或胎儿肝祖细胞是出生前拥有的或来源于造血干细胞，并不断从循环单核细胞中补充。对于循环细胞，scRNA-seq数据对潜在前体与分化的组织巨噬细胞之间的转录相似性和轨迹进行定量，可以推断出巨噬细胞的个体发育（图5b）。
组织特性
体内每个器官的稳态功能所产生的环境是独特的，并且会影响器官内驻留的免疫细胞的基础活化状态和转录组。例如，肠道中的免疫细胞必须适应它们与肠腔内数万亿种微生物的紧密环境，而肾脏髓质内的那些则暴露于明显的高盐环境。小鼠巨噬细胞的研究表明，由于来自局部细胞邻域的线索以及对周围环境的采样，驻留在不同器官中的巨噬细胞采用了组织特异性转录基因标记。使用scRNA-seq对不同器官中免疫细胞亚群的比较，将为组织驻留免疫细胞的器官特异性标记基因提供更大的见解（图5c）。此外，由于已经在许多中心建立了从器官供体采集多个样品的基础设施，因此对来自人体器官的细胞进行此类研究的能力已成为现实。
免疫细胞相互作用
组织驻留的免疫细胞占据特定的位置，周围的细胞产生吸引和容纳它们的趋化因子，以及保持活力所需的存活因子。循环系统的免疫细胞还必须与器官内的血管内皮细胞紧密相互作用。另外，最近几年的小鼠研究表明，一些组织驻留的免疫细胞与可电激发的组织紧密相互作用。例如，心脏巨噬细胞与心脏传导系统的心肌细胞形成间隙连接，以促进电传导。在肠道中，巨噬细胞与肠神经元相互作用，促进蠕动，某些转录上不同的巨噬细胞亚群与组织脉管系统紧密结合。scRNA-seq提供了一种研究这些基础相互作用的方法，因为可以为每种细胞类型生成受体和配体表达的目录，并根据这些数据推断出相互作用（图5d）。现在，许多研究人员已使用这种方法来研究组织内免疫细胞相互作用的性质。例如，使用scRNA-seq探索发育中的小鼠肺组织内的配体-受体，研究表明肺部环境中产生的信号（IL-33和GM-CSF）引发了肺部嗜碱性粒细胞的嗜碱性，因此嗜碱性粒细胞表达了特定的标记基因，使他们能够支持肺泡巨噬细胞发育。另一项小鼠胃肠道内上皮scRNA-seq的研究表明，细胞具有多种亚群，并阐明了这些细胞如何保持体内稳态并与病原体相互作用。此外，这项研究还确定了细胞簇的两个特定亚簇，其中一个表达Tslp，它通过TH2 CD4+ T细胞和ILC2s提升TH2细胞应答来介导上皮-免疫相互作用。
其他大规模分析研究其他器官的信号网络也提供类似的见解。目前，使用人体胎盘组织进行了最全面的人体器官系统中细胞间通讯的研究。使用scRNA-seq以单细胞分辨率在人胎盘内定位信号传导网络，可区分一系列母体和胎儿以及免疫和非免疫细胞类型。参与该研究还开发了CellPhoneDB的工具，可以查询不同细胞类型中配体-受体的表达，从而有助于分析免疫细胞与其他组织驻留细胞类型的相互作用。该工具现在已可用于scRNA-seq数据集。
解剖定位
如前所述，高通量scRNA-seq和质谱分析实验利用解离的组织样品，不可避免地会丢失有关器官内细胞解剖位置的信息（图5e）。许多例子表明，器官内免疫细胞的特定定位是优化器官防御和功能所必需的。例如，在皮肤中，DC位于毛囊附近，以便对皮肤进行最佳采样，而具有高吞噬能力的肾巨噬细胞位于髓质和骨盆中，以处理从膀胱来的细菌。通过参考活检位置，可以在宏观解剖学上解决使用解离的组织样本的实验。但是，将需要使用空间转录组学方法来了解特定细胞群体在3D空间中的相互作用。
衰老和疾病的免疫
scRNA-seq还具有解决许多重要问题的潜力，这些问题涉及衰老和疾病期间组织内免疫细胞的变化。例如，研究人员将患病或衰老组织的单个细胞的转录组与健康或年轻组织的细胞的转录组进行了比较。2019年的一项研究使用大规模细胞计数法和scRNA-seq研究克罗恩病患者发炎和未发炎的回肠的细胞图谱，利用炎性巨噬细胞的信号，表明发炎组织中炎症巨噬细胞和成熟DC的富集以及组织病原细胞的组成。该细胞模块相关的基因表达与抗肿瘤坏死因子（TNF）治疗的抗性相关，为诊断患者进行分层提供参考。在一项针对类风湿关节炎患者的研究中，在关节置换术时对20000多个滑膜细胞进行了scRNA-seq测序。该研究鉴定了13个细胞簇，包括CD4+和CD8+ T细胞、B细胞、浆细胞、NK细胞、巨噬细胞、DC细胞和肥大细胞，以及几种不同类型的成纤维细胞。免疫细胞中富含炎性细胞因子基因，并且发现NK细胞亚簇具有高表达的XCL1和XCL2，这些趋化因子已被证明可调节成纤维细胞分泌的基质金属蛋白酶，表明可能驱动疾病的细胞间相互作用。
与具有粘膜面向外部环境的组织相反，中枢神经系统（CNS）是无菌的部位。小胶质细胞是人类CNS中的MNP细胞群体，被认为在健康和疾病中具有多种作用。对小鼠和人类脑细胞进行scRNA-seq分析，可以研究小胶质细胞和血管周巨噬细胞。这种方法已扩展到阿尔茨海默症的小鼠模型，能够鉴定出与神经退行性疾病有关的独特的小胶质细胞群体，名为疾病相关的小胶质细胞（DAM）。这些细胞可感知并响应神经退行性变，并引起保护性反应。有趣的是，HIV感染患者的脑脊液中免疫细胞的scRNA-seq识别出了罕见的小胶质细胞，这些细胞富含阿尔茨海默症小鼠中鉴定出的相同DAM标记基因。许多研究人脑中不同的小胶质细胞群体及其与疾病的关系。例如，一项使用scRNA-seq、单分子荧光原位杂交和免疫组化技术的研究，在发育、健康和疾病群体中研究小鼠和人类小胶质细胞的转录和蛋白质图谱。对健康人脑和多发性硬化症患者的大脑皮层小胶质细胞进行的分析中，研究人员鉴定出了7个小胶质细胞簇，其中两个富集于多发性硬化症患者的大脑中，而一个专属于多发性硬化症患者的大脑。这些数据表明，即使在健康群体中，人类的小胶质细胞以及转录上与疾病相关的细胞亚群也存在异质性。另一项研究对健康大脑和受多种疾病（包括阿尔茨海默症和多发性硬化症）影响的患者的大脑中的小胶质细胞进行了分析，结果表明与疾病相关的小胶质细胞转录组多样性与小鼠中鉴定的DAM表达谱一致。同一研究小组还检测了老年人的小胶质细胞，并鉴定了一系列基因，这些基因在老年人脑中优先由小胶质细胞表达，并富含阿尔茨海默氏症和多发性硬化症的易感基因。
肿瘤代表独特的疾病状态，并改变组织环境以创造抑制免疫细胞活化的环境。使用单细胞技术可以更好地研究这种现象的机制。例如，许多研究小组将scRNA-seq与T细胞受体重组相结合，更好地了解调节各种癌症（包括肝细胞癌、卵巢癌和结肠直肠癌）中与肿瘤相关的T细胞克隆性和功能障碍的机制。
这些研究共同说明了单细胞技术可以提供健康和疾病组织免疫研究的见解，并提供了可用于人类肾脏免疫研究的手段。
健康人群的肾脏免疫
肾脏通过排泄废物和酸并维持电解质和水的平衡，在维持体内稳态方面起着至关重要的作用。它们还产生刺激红细胞生成的激素以预防贫血（促红细胞生成素），以及1α-羟化酶生成维生素D以保持骨骼的钙和磷酸盐水平。肾脏中的各种细胞（包括上皮细胞、肾小球膜细胞、内皮细胞、神经元细胞以及免疫细胞）的相互作用来维持正常的肾功能。由于肾脏稳态功能，在肾脏组织环境中存在区域差异（图5e）。肾脏的延髓和内部区域拥有较高的间质钠浓度，这主要是由于Henle环内的离子运输所致，这是肾脏实现体内水分吸收再平衡功能所必需的。肾脏也是一个动态的环境，肾脏内的钠浓度梯度调节取决于生理需要。例如，由于脱水和血清渗透压升高，垂体后叶分泌的血管加压素增加了肾脏对游离水的重吸收，并在髓质中进一步增加了间质钠浓度。除盐差异外，明显的加氧作用的区域差异也很明显。远端肾单位的血液供应随肾小球小动脉的血管收缩程度而变化，并且肾小管细胞将电解质、葡萄糖和氨基酸输送到间质的代谢要求，导致延髓中不同程度的缺氧。这些环境条件可能通过直接影响免疫细胞，或由上皮细胞、内皮细胞或基质细胞介导，在塑造器官的免疫结构中发挥巨大作用。
肾脏内细胞转录图谱的首次研究是在健康的小鼠肾脏中进行的。研究人员使用scRNA-seq的方法鉴定了肾单位上皮细胞的主要亚群，包括足细胞、近端小管上皮细胞、Henle环细胞、远端小管和收集管细胞。收集管细胞包含一种新型的过渡细胞类型，该类型的细胞能够在闰细胞和主细胞之间进行转换。这项研究强调了小鼠肾脏中存在免疫细胞的多样性，包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞、B和T淋巴细胞以及NK细胞。这些发现得到了另一个研究的补充，该研究使用scATAC-seq评估了13个小鼠组织（包括肾脏中的上皮、内皮和免疫细胞）大约100000个单细胞的染色质可及性。这项研究表明，来自肾脏、心脏和肝脏的组织巨噬细胞显示出染色质可及性的常见模式，这与肺泡巨噬细胞和小胶质细胞的模式不同。
目前，在健康人群中全面研究肾脏免疫种群的能力还很有限。一项研究利用22000个细胞生成转录数据，提供人肾脏中细胞类型的图谱，报道了一组异质的免疫细胞，包括B细胞和浆细胞、两个髓样细胞亚群、T细胞，NK细胞和肥大细胞。我们小组还对人的肾脏进行了大规模研究，使用scRNA-seq对不同寿命人类的14个肾脏以及6个胎儿人肾脏中的67000多个细胞进行了分析。我们的发现证实了人类肾脏内存在复杂的免疫环境，主要表现为MNP细胞、NK细胞和T细胞。髓样细胞的精细聚集显示了两个单核细胞衍生的巨噬细胞群，一个与CD14+经典单核细胞的转录相似，另一个与CD16+非经典单核细胞的转录相似，以及一个独特的组织巨噬细胞群。人肾中的DC主要表达与cDC2表型一致的标记基因，例如CD1C。我们还考虑了肾脏内免疫细胞的宏观解剖定位，参考了从已知肾脏区域采集的活检样本中获得的大量RNA序列数据。该分析显示了皮质与髓质和骨盆之间的免疫细胞亚群的分布差异。配体-受体相互作用的分析表明，由于盆腔上皮细胞中趋化因子的表达模式，中性粒细胞和抗菌MNPs在盆腔富集。利用小鼠模型，研究者证实了这些相互作用将中性粒细胞特异性地定位在肾脏区域。因此，我们的研究表明，人类肾脏是一个高度组织化的免疫环境，不同的区域表现出功能特异性，这些区域可能适应主要的免疫挑战。
另一个研究小组使用大量细胞计数法分析了人类肾脏样品中的免疫细胞。尽管这项研究的重点是肾细胞癌（RCC），但研究人员还对健康的肾脏组织进行了细胞计数作为比较。使用一组互补的标记基因可以分离T细胞和髓细胞异质性。研究结果表明正常肾脏样本中CD4+中枢记忆T细胞，CD4+和CD8+效应记忆T细胞富集。然而，正常样本中没有表达PD-1的调节性T细胞和T细胞，表明肿瘤微环境中的免疫抑制程度增强。研究人员还观察了正常肾脏组织中的经典和非经典单核细胞，在健康组织中有一群表达CD206、M2极化的组织驻留巨噬细胞。
对发育中的人类肾脏的研究，不仅揭示了上皮细胞发育的模式，而且还揭示了在妊娠87-132天的时间里，主要表达组织相容性复合体II类（MHCII）基因的组织驻留免疫细胞。与胎儿肾脏早期出现巨噬细胞的研究一致，在人类胎儿肾脏中的研究显示了表达MHC II类基因、IL1B和FCER1G基因的免疫细胞簇。scRNA-seq相关研究表明，在孕早期，巨噬细胞在人类胎儿肾脏的固有免疫细胞中占主导地位，但是从受孕后第9周开始，其他免疫细胞亚群（包括DC和淋巴细胞）增加。这些发现与小鼠研究的数据一致，表明肾脏中的组织驻留巨噬细胞不仅仅源自骨髓衍生的单核细胞，而且可能在胚胎发育早期源自胎儿卵黄囊或肝脏的红髓细胞前体。
疾病人群的肾脏免疫
肾脏可能会受到许多普遍和严重疾病的影响，包括急性肾脏损伤、肾小球肾炎、上行感染（肾盂肾炎）和癌症。在每种情况下，免疫系统对病原体或危险信号或恶性细胞的识别和应答都是至关重要的。此外，在肾移植中，供者来源的组织免疫细胞群可以被受体细胞取代，尤其是在排斥反应期间。维持性免疫抑制也会影响免疫细胞的表型、转录组和功能。
肾活检在肾病学诊断中起着核心作用，并且是一种有用的组织来源，可用来研究免疫细胞群并确定细胞状态和频率如何随疾病发作和进展而改变。但是，这种活检方法仅获得相对较小的组织样本，并且仅常规在外肾皮质采样。然而，许多小组已开始优化方法，以使scRNA-seq可以在临床活检样本上进行。
狼疮性肾炎。对肾活检样本进行scRNA-seq的一项早期工作是使用狼疮性肾炎患者的肾脏（n=16）和皮肤（n=12）活检样本，以及来自健康个体的5个皮肤活检样本，生成899个细胞的数据。在上皮细胞中，研究人员发现了活动性狼疮性肾炎患者的肾小管细胞和皮肤角质形成细胞中I型干扰素标记基因的表达，突显了使用更容易获得的皮肤样本评估系统性疾病的潜在实用性。在这些肾脏样本中鉴定出的免疫细胞数量非常有限，但包括少数T细胞和髓样细胞。
研究人员现在正在努力建立狼疮性肾炎患者肾脏中免疫细胞的详细图谱，采用测序前富集免疫细胞的策略。Accelerating Medicines Partnership网络的数据表明，狼疮性肾炎患者的肾脏包含丰富的免疫细胞，包括炎性和吞噬巨噬细胞、DC、NK细胞和一系列记忆性T细胞。一部分B细胞和浆细胞（自身抗体的来源）表达了I型干扰素标记基因，表明这些细胞是疾病发病机理的重要参与者。进一步的研究可以根据患者单细胞转录组学的主要特征对患者进行分层，并提供对特定B细胞克隆是否在组织损伤部位延伸的见解。
Accelerating Medicines Partnership网络还证明了对尿液样本中的细胞（包括免疫细胞）进行scRNA-seq的可行性，提供了以无创方式检测肾脏免疫细胞的潜在的手段。Accelerating Medicines Partnership网络已尝试将有关SLE患者全基因组关联研究（GWAS）中鉴定的疾病易感基因的信息，与狼疮性肾炎患者活检样本scRNA-seq获得的细胞基因表达信息进行整合。同样，另一项研究将GWAS和其他遗传研究确定的易感基因映射到小鼠肾脏的scRNA-seq获得的单细胞簇的基因表达谱中，发现了疾病相关基因的细胞类型特异性表达。因此，该方法提供了一种额外的手段，可以结合scRNA-seq数据更好地了解构成疾病发病机理的细胞亚群。
移植。另一项研究比较了两个高通量scRNA-seq系统Drop-seq和inDrop从人肾活检样本中产生单细胞转录组的效率。最终，inDrop产生了优异的结果，研究人员随后对从同种异体移植的急性抗体介导排斥（ABMR）的肾脏活检样本中获得的4487个单细胞进行了scRNA-seq，并对健康对照肾脏中获得4259个单细胞进行了细胞核RNA-seq。在同种异体移植样本中，研究人员鉴定出三个不同的内皮细胞簇，其中两个似乎被激活，其Fc受体信号通路的上调与ABMR的诊断相符。免疫细胞浸润中存在单核细胞、B细胞、浆细胞和T细胞，CD16–单核细胞中的基因表达模式表明DC细胞成熟。浆细胞的存在与供体特异性抗体的局部产生相共存，这具有治疗意义。值得注意的是，在这项研究中使用的健康对照肾脏样本中未鉴定出免疫细胞。这些细胞的缺失可能与用于生成这些数据的不同平台有关，并且采样的细胞核数量相对较少。
肾脏癌。免疫细胞浸润也存在于肾脏肿瘤中，但其表型和功能可能会因肿瘤微环境而改变。免疫细胞浸润的程度是RCC患者预后不良的独立因素，强调了肿瘤与免疫细胞相互作用的重要性。一项研究使用大规模流式细胞术的方法来鉴定RCC中疲惫性和调节性的T细胞，以及各种表达与肿瘤和抗肿瘤表型相关的标志基因的巨噬细胞。疲惫性的T细胞的频率与CD38+肿瘤相关的巨噬细胞的频率相关，并与无进展生存相关，这突出了使用单细胞技术进一步了解肿瘤进展和转移中的免疫情况。我们使用scRNA-seq比较了肾脏肿瘤内的细胞与正常幼儿、成年和胎儿肾脏中肾小管上皮细胞的转录谱，并鉴定了可能导致Wilms肿瘤和RCC发生的细胞起源。这项研究还揭示了表达血管内皮生长因子A（VEGFA）的RCC相关巨噬细胞群，其蛋白产物促进并成为该恶性肿瘤现代治疗方案的靶标。这说明scRNA-seq解决肿瘤个体发育问题的能力，以及确定可能适合药理学治疗的病理生理机制和细胞信号网络的能力。
总结与展望
单细胞技术有望更广泛地转变我们对免疫学和人类生物学的理解。研究人体血液、次级淋巴器官和整个组织（包括肾）产生的数据有可能构成人类细胞图谱的一部分，这是一项国际性的工作，旨在产生不同年龄、健康和疾病的人类细胞的全面而系统的参考图谱，供研究人员自由获取。最终，这种资源将为生物医学研究界研究一系列生物学问题的细胞状态提供参考。在肾脏病学中，翻译潜力是显而易见的。对肾细胞异质性以及这种异质性如何通过发育和疾病变化将有助于药物靶标的鉴定，并改善脱靶作用的预测。将单细胞技术应用于临床肾脏活检样本或尿液中的细胞，将提高肾病学和移植的诊断准确性，并有助于个性化预后。在影响肾脏的全身性自身免疫性疾病中，对外周血和次级淋巴器官的分析将产生相似的见解，并有助于揭示自我耐受性下降的原因和性质。最后，在再生医学中，单细胞分析将使人们能够更好地了解体外细胞分化与体内细胞状态的比较，从而促进组织置换甚至器官的发育。这些数据加在一起，将有可能以类似于人类基因组计划的方式转化生物学和医学，从而开创了理解生理和疾病过程的新时代。
更多推荐
1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响