科研 | Chemosphere：转录组应用之环境化学评估：斑马鱼胚胎的浓度依赖性（国人佳作）

编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。

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导读

在生命早期接触环境中有毒化学物质会对生物体的发育和健康产生长期影响。使用基于表型的斑马鱼胚胎高通量筛选（PHCS）已广泛用于快速化学毒性测试中，该测试可同时评估多个效应。美国环境保护署（EPA）对1060种化学物质进行的ToxCast第1和第2阶段测试，鉴定出487种（46％）化学物质在与环境相关的浓度下明显诱导了胚胎毒性，但未鉴定出具有高生物活性的化学物质。化学物质无胚胎毒性，没有明显的表型效应的生命早期阶段的生物途径变化仍可能导致成年人患上各种疾病。环境化学品的作用模式（MOA）通常指变化的生物途径，可以预测生命早期环境暴露后可能的长期不良后果。因此，要筛选和评估大量化学物质的潜在不利影响，使用高通量方法快速有效地确定其在早期生命暴露期间的分子机制仍然很重要。浓度依赖性转录组提供了最广泛的生物途径覆盖，这些途径在毒性过程中可能会受到干扰。到目前为止，通过转录组采用多种浓度设计仅研究了少量化学物质。这些研究中的测试浓度范围在1-2个数量级以内，尽管宽的浓度范围对于捕获环境化学物质的出发点（POD）至关重要。最近，研究人员通过测量了斑马鱼中95％的生物学途径（GO和KEGG途径）的1637个核心基因的基因表达，开发了简化的斑马鱼转录组（RZT）方法，从而可以进行广泛的浓度范围分析（例如7个数量级的数量），成本大大降低。但是，CRZT方法是否可以有效诊断和评估具有不同MOA的环境化学品仍然有待验证。

论文ID

原名：Concentration-dependent transcriptome of zebrafish embryo for environmental chemical assessment

译名：用于环境化学评估的斑马鱼胚胎的浓度依赖性转录组

期刊：Chemosphere

IF：5.1

发表时间：2019年12月12日

通讯作者：张效伟教授

通讯作者单位：南京大学

DOI号：10.1016/j.chemosphere.2019.125632

实验设计

为了探索和评估使用浓度依赖性转录组的化学测试的有效性，采用CRZT结合PHCS的方法对5种不同MOA的12种环境化学试剂进行了测试。与PHCS方法相比，对CRZT的反应性，敏感性和对有毒化学物质的机械区分进行了评估。 PHCS方法旨在评估120 hpf时的不良表型结果。具体操作流程如图1所示。

图1 A，基于表型的高内涵比较分析的工作流程。 B，浓度依赖性转录组分析和转录组效价计算示意图。

结果

1响应性分析

除BaP和BbF外，在12种化学药品中，有10种引起明显的死亡率和畸形毒性。在17120个hpf的顶端终点中，有六个受到至少一种化学物质的干扰。主要的形态学缺陷是PE（心包水肿），JAW（下颌），YSE（卵黄囊水肿），UNHATCH（非孵化）和AXIS（体轴）（图2A）。除DFC的效力较高而CPD的效力较低外，10种单一化学物质的120 hpf  LD50值与先前报道的48 hpf LD50值一致。该发现与先前的研究一致，后者表明BaP和BbF暴露后未观察到胚胎毒性。

BbF是在转录组学上最敏感的化学品，尽管它没有胚胎毒性。较低浓度的BbF干扰的敏感生物过程主要是骨骼系统发育（POD子过程，0.003μM）和心血管系统发育（POD子过程，0.03μM）。此外，BaP也没有导致胚胎毒性，但再转录组上能强烈干扰发育过程，尤其是内分泌（POD子过程，0.002μM），骨骼（POD子过程，0.02μM）和心血管系统（POD子过程，0.03μM）（图2B）。

图2. 表型反应和转录生物途径变化概况

2 敏感性分析

PHCS测试了10种化学物质的斑马鱼胚胎毒性，等级如下：DFC> TCS> CLP> GES> CPD> DIR>DAZ> PCZ> BPA> TPP（图3A）。CRZT测试了12种化学物质的转录组效价范围，效价等级为：BbF> DFC> TCS> CLP> BPA> BaP>PCZ> TPP> GES> CPD> DAZ> DIR（图3 B）。转录组效价的排序顺序与胚胎毒性的排序顺序不同（图3A和B），这些差异可能由两种测试方法的性质导致的。在这项研究中，CRZT用于评估生物学反应过程，而PHCS主要用于评估胚胎毒性。但12种化学物质之间的转录组效价和胚胎毒性呈正相关。只有两个内分泌干扰物BPA和GES落在相关性的95％CI（置信区间）之外（图3C），这表明32 hpf不是内分泌干扰物最敏感的测试阶段。但是，畸形效应浓度（最低LOEC）和转录组潜能显示出弱的正相关性（P值> 0.05）（图3D），可能是由于有效浓度的计算导致的。因此，CRZT可以通过捕获生物途径变化，提供了除胚胎毒性外的化学危害的补充知识。

图3. 基于表型的高通量筛选（PHCS）和浓度依赖性的斑马鱼转录组变化（CRZT）在12种化学物质中的效能曲线。

3 机械分化分析

根据PHCS测试的特征将十二种化学药品分为五组。在第1组中，DIR与两个内分泌干扰物（BPA和PCZ）聚集在一起（图2，图4A）。在第2组中，DAZ和两个AhR激活剂（BbF和BaP）聚集在一起，他们都几乎没有观察到胚胎毒性。第三组包括DFC，TCS和CLP，它们具有最高的死亡率和较低的畸形评分。第4组由具有相似毒性模式（PE，JAW，YSE，UNHATCH和AXIS）的GES和CPD组成。最后，畸形评分最高的TPP没有与其他化学物质聚集在一起。

基于转录组效价的NES评分的分类显示出与预期的MOA相匹配的化学模式，并且12种化学物质也被分为5组（图4B）。在第1组中，BaP首先与CPD聚集在一起，然后与BbF聚集在一起，这会严重干扰内分泌，增殖和代谢过程，尤其是DNA损伤过程。第二组包括PCZ和BPA，它们在大多数生物学变化都具有相似的NES评分，包括增殖，应激反应，信号传导，细胞成分，细胞生长和死亡，定位和发育过程。第3组由TCS和DFC组成，它们在32个hpf斑马鱼胚胎中也都具有最高的NES评分（图2，图4B）。最后，将效力最弱的两种化学品DIR和CLP归为一组（图2B）。但由于缺乏分子机理信息，基于毒性模式的分类结果与预期的MOA不一致。与PHCS相比，CRZT方法可以通过全面表征生物过程来区分不同MOA的化学品。

图4. 基于表型的高通量筛选（PHCS）对12种化学品进行聚类分析

结论

结合基于表型的斑马鱼胚胎高含量筛选（PHCS），浓度依赖性转录组（CRZT）显着提高了代表不同作用方式（MOA）的化学测试的响应度，敏感性和机理差异。首先，CRZT捕获了针对早期生命化学暴露的全面生物活性。其次，与PHCS相比，CRZT提供了一种更灵敏的方法来鉴定化学效力，幅度为1-3个数量级。第三，CRZT可以有效地对具有不同MOA的化学品进行分类。CRZT方法与PHCS结合使用为环境化学物的诊断和评估提供了有希望的工具。我们建议未来的研究将CRZT方法应用于代表不同MOA的更多化学品，以验证这一结论。此外，仅在8–32 hpf暴露量下评估CRZT的应用。需要进行进一步的研究以调查多次时间序列接触是否可以增强CRZT的化学评估性能。

评论

筛选和预测大量化学物质在生命早期活动期间对生物体的不利影响至关重要。可以根据不同浓度的组学获取其对生物途径或过程的变化程度，并提供有关毒性机理信息。但是，浓度依赖性转录组在评估环境化学物质发育毒性方面的应用仍然受到限制。本研究通过斑马鱼浓度依赖性还原转录组方法（CRZT）与基于表型的高通量筛选（PHCS）结合，测试了代表五种不同作用方式（MOA）的十二种化学物质。与PHCS相比，CRZT的反应性，敏感性和机制分化得到了验证。首先，PHCS确定了10种具有明显胚胎毒性的化学物质，而CRZT证实了12种化学物质干扰的生物途径的效力。其次，尽管对于大多数测试化学品而言，转录组变化的效力与半数致死率呈正相关，但无胚毒性的BbF对生物途径的变化最为有效。最后，CRZT捕获的受扰生物过程和转录组效价的概况可以有效地对大多数化学物质进行分类，这些化学物质和它们的已知MOA相对应。总而言之，CRZT可以显著改善环境化学物质的发育毒性测试。

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