科研 | 台州大学：代谢组和转录组联合分析鉴定青钱柳叶片中参与酚酸生物合成的候选基因
编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
天然酚类化合物通常存在于植物中，并构成最大的植物化学物质。多酚是植物的次生代谢产物，可分为不同的组，例如酚酸，类黄酮，单宁，对苯二酚和木脂素。这些化合物具有不同的作用，例如信号分子，植物防御剂和植物生长素运输调节剂。另外，由于它们的抗氧化活性和清除自由基的能力，已经对这些化合物进行了充分的研究。它们还具有多种健康益处，例如抗炎，抗菌，抗增殖，抗癌，抗氧化特性。 苯酚酸是芳香族羧酸的羟基衍生物，广泛分布于植物中，分为两类：羟基苯甲酸衍生物和羟基肉桂酸衍生物。酚酸是通过苯丙烷途径在植物中产生的。这些是monolignol途径的副产物，是维管植物中木质素和细胞壁聚合物的分解产物。植物中酚酸合成中涉及的两个主要氨基酸包括苯丙氨酸和较小程度的酪氨酸。脱氨基，羟化和甲基化是酚酸形成的三个主要反应。首先，发生苯丙氨酸和/或酪氨酸的脱氨基反应，分别产生肉桂酸和/或对香豆酸，肉桂酸和对香豆酸的芳环然后被羟基化和甲基化以形成其衍生物阿魏酸和咖啡酸。此外，这些酚酸含有C6-C3结构，并被用作木质素和其他酚类化合物的合成前体，关于酚酸生物合成的知识比关于类黄酮和单木酚的知识少，迄今为止，该途径的许多步骤仍然未知。最近，酚酸受到越来越多的关注。然而，大多数植物酚类研究集中在检查蔬菜和水果中的这些化合物。代谢组学数据可提供有关组织生化状况的大量信息，对其解释可提供可用于基因功能表征的有效方法。此外，代谢组学分析可以被视为关联分析的技术手段。结合其他数据，可用于分析目标代谢途径中涉及的基因功能，还可为基因挖掘提供支持信息。高通量测序，高分辨率质谱和信息处理技术的最新发展和应用对于探索主要生物学现象的系统生物学研究已变得不可或缺。转录物和代谢物数据集通过相关性和聚类分析进行了组合，可以表示为基因与代谢物之间的连接网络，可以揭示水稻对夜间温度升高的响应机制，这是花朵中飞燕草素的调节机制。葡萄风信子的颜色，马铃薯的色素沉着机理，睡莲的蓝花形成机理和白化茶品种“玉金香”的儿茶素生产。此外，转录组学和代谢组学的整合为确定关键代谢途径的生物合成机制提供了显着优势。迄今为止，尚未通过转录组学和代谢组学数据的组合分析研究酚类化合物的生物合成。Cyclocarya paliurus（Batal）Iljinskaja是Cyclocarya的唯一种，在中国俗称“甜茶树”，被用作中药。它广泛分布于中国的亚热带地区。在中国，传统上将青钱柳用作保健食品已有1000多年的历史。青钱柳的叶子已被用作功能食品或保健茶，用于治疗多汗症，高血压和糖尿病。2013年，中国国家卫生和计划生育委员会已将青钱柳叶片批准为新的食品原料。有人提出，青钱柳叶片中的生物活性物质是其治疗作用的原因。由于其各种健康益处，需要大量生产假单胞菌叶子。尚未对不同发育阶段的青钱柳叶片中酚酸的积累和酚酸生物合成基因的表达模式进行了研究。本研究采用综合的转录组学和代谢组学技术研究酚酸含量的变化以及参与酚酸合成途径的不同表达基因的变化，旨在发现：酚酸合成途径和在不同发育阶段的青钱柳叶片中酚酸合成的调控机制。
论文ID
原名：Combined Analysis of the Metabolome and Transcriptome Identified Candidate Genes Involved in Phenolic Acid Biosynthesis in the Leaves of Cyclocarya paliurus
译名：代谢和转录组组合分析鉴定青钱柳叶片中参与酚酸生物合成的候选基因
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.32
发表时间：2020.02
通讯作者：李俊民
通讯作者单位：台州学院浙江省植物进化生态学与保护重点实验室
DOI号：10.3390/ijms21041337
实验设计
结果
1.不同发育阶段青钱柳叶片中酚酸生物合成基因的表达
基于KEGG数据库中的苯丙烷类生物合成，基于检测到的代谢物构建了青钱柳叶片的酚酸合成途径，共鉴定出58个基因参与酚酸的生物合成途径（图2A）。通过四个开发阶段的比较，共鉴定出10个DEG，包括一个PAL基因，一个C4H基因，一个F5H基因，一个COMT基因，两个UGT72E基因，一个HCT基因和一个咖啡酰-CoA O-甲基转移酶基因（图2B）。两个DEG的表达随着发育阶段的进展而降低，并且基因表达在F1阶段最高。在F2阶段，只有一个DEG的表达先上升然后下降，并且最高。其他DEGs遵循不同的表达趋势，但是在F4阶段它们的所有基因表达水平最高。酚酸生物合成途径共涉及22个转录因子（TF），包括12个MYB TF和10个基本螺旋-环-螺旋（bHLH）TF（图2C）。
图1 青钱柳酚酸生物合成通路。
图2 酚酸生物合成通路基因热图（A），酚酸生物合成通路基因的差异表达情况（B），MYB、bHLH转录因子基因热图（C）。
2.酚酸生物合成通路中代谢产物的鉴定
共检测到14种涉及酚酸生物合成途径的代谢物，包括6种酚酸（肉桂酸，咖啡酸，绿原酸，阿魏酸，芥子酸和对香豆酸）（表1）。差异累积代谢物（DAM）的定义是叶片发育阶段之间倍数变化≥2或倍数变化≤0.5且项目重要性（VIP）≥1的变量。检测到八个DAM，包括两种酚酸（对香豆酸，芥子酸），其他代谢物被鉴定为丁香精，松柏素，芥子醇，芥子酸苹果酸，L-苯丙氨酸和松柏醇。 DAM的含量在四个发育阶段表现出不同的表达趋势，但所有八个代谢产物的含量在F4阶段最高。
表1 酚酸生物合成通路中的代谢物含量及种类
3.代谢组、转录组综合分析
为量化基因与代谢产物之间的关系，作者通过关联性分析将转录组和代谢产物数据一体化，并建立了量化转录本-代谢物关系的网络。代谢物和转录组数据经过log2函数变换，然后进行关联性分析。引入该分析中的配对要求Pearson关联系数（PCC）≥0.9、p<0.05。共鉴定出64个关联对，使用Cytoscape软件（3.6.1版本）将它们可视化。可视化网络显示，共有47个节点，由64条边连接。这47个节点包括了32个基因和15个代谢物。43对为正相关，21对为负相关（图3）。在酚酸生物合成中，共发现6个候选DEG，包括PAL (TRINITY_ DN87383_c2_g1)、C4H (TRINITY_DN83539_c2_g6)、CAD(TRINITY_DN92541_c0_g1)、COMT (TRINITY_DN95472_c1_g2)、HCT (TRINITY_DN97112_c1_g2)和UGT72E (TRINITY_ DN93270_c1_g1)。上述结果表明，参与酚酸生物合成的某些DEG与对应的代谢物有高度关联性。转录组数据验证了代谢组数据的可靠性、精确性。
图3 不同发育阶段摇钱树叶片中结构基因和酚酸生物合成通路代谢物的共表达分析。
4.参与酚酸生物合成转录因子的筛选和系统发育分析
为系统地鉴定操控青钱柳不同发育阶段叶片中酚酸生物合成的未知假定转录因子，对代谢通路基因和差异表达的转录因子进行了共表达分析。以前期筛选出的6个酚酸生物合成基因（编码PAL、C4H、CAD、COMT、UGT72E、HCT的基因）作为“引导基因”，鉴定共表达特异关系。通过与PlantTFDB数据库比较，共鉴定出386个差异表达转录因子。在引导基因和差异表达转录因子之间进行关联性分析，配对要求PCC≥0.9、p<0.05。共鉴定出44对关联配对，并使用Cytoscape软件将其可视化。可视化网络显示，414条边将134个节点连接，包括6个引导基因和128个转录因子（图4）。在已鉴定的共表达转录因子中（p<0.05），MYB、bHLH、ERF家族成员是正相关转录因子中最多的成员。
由于MYB和bHLH是参与酚酸生物合成的两个最重要转录因子，所以青钱柳的MYB和bHLH基因被分别用于和拟南芥R2R3MYB转录因子、拟南芥bHLH转录因子构建系统发育树。12个MYB转录因子分为6枝，TRINITY_DN86884_c1_g7、TRINITY_DN92774_c0_g3、TRINITY_DN89360_c1_g9、 TRINITY_DN91730_c2_g1、TRINITY_ DN97533_c2_g5 基因显示出与AtMYB39、AtCDC5、AtMYB91的同源性，它们聚为最大一枝。
参照KEGG数据库苯丙素生物合成方法（图5），构建青钱柳叶片中酚酸合成通路。网络构建综合了所有代谢物、基因、转录因子的结果，以直观表达转录因子调控的基因表达、基因表达、代谢物累积之间的关系。转录因子与结构基因的增强子结合，因此，假设转录因子通过结合到结构基因的增强子上从而激活基因表达，包括代谢物积累。包括PAL、C4H、CAD、COMT、HCT等酚酸生物合成通路中的结构基因受到许多MYB和bHLH转录因子的调控。所有经由关联性分析筛选出的MYB和bHLH转录因子都显示出相似的表达趋势，而且在F4阶段高表达，这种情形与多数差异表达的结构基因很相似（图2C）。特别地，本研究得到了12个MYB、10个bHLH转录因子、10个差异表达结构基因作为候选基因。它们可以被用于研究青钱柳叶片不同发育阶段酚酸生物合成背后的调控机制。
6.转录组数据的RT-qPCR验证
使用qRT-PCR分析青钱柳中参与酚酸生物合成的酶和转录因子的基因转录丰度。根据4个发育阶段基因表达水平的差异，筛选出18个基因进行qRT-PCR，包括6个结构基因（PAL、C4H、HCT、CAD、COMT和UGT72E）、6个MYB转录因子和6个bHLH转录因子。18个基因与RNA测序数据中的表达模式相似（图6）。因此，本研究数据可用于研究青钱柳中的酚酸生物合成和代谢相关基因。
图4 青钱柳叶片中酚酸生物合成通路结构基因和转录因子共表达分析。黄色节点为MYB转录因子。绿色节点为bHLH转录因子。亮蓝色节点为CO样转录因子。蓝色节点为乙烯反应转录因子（ERF）。粉红色节点为种类激活物样效应器（TALE）转录因子。橙色节点为NAC（NAM、ATAF、CUC）转录因子。灰色节点为其他转录因子。红色边为正相关，绿色边为负相关。
图5 青钱柳不同发育阶段叶片中酚酸生物合成调控网络。红色框为检测到的代谢物。实线框为一步过程，虚线框为多于一步过程。黑色箭头为MYB和bHLH转录因子可能的方向。粉色箭头为酚酸生物合成方向。
图6 实时聚合酶链式反应（PCR）验证RNA测序中参与酚酸生物合成候选的unigene。直方图显示实时PCR测得的相对基因表达量。转录组中每一百万个比对碎片中的TPM以折线图表示。左侧y轴为实时PCR测得的相对基因表达量。
讨论
评论
更多推荐
1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响