编译：贤，编辑：十九、江舜尧。
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导读
在20世纪70年代就提出了“个性化治疗”的概念，到2002年，国际上完成了人类基因组计划，随着技术的不断发展，2013年在中国召开了国际肿瘤精准医学会议。转录组学技术也应用到了精准肿瘤学上，为个性化治疗添砖加瓦。转录测序技术发展较晚，目前正处于高速发展阶段，此时应用于精准医疗上，有优势也有不足之处，本综述将从过去、现在、将来的发展趋势详细剖析转录学技术应用到精准肿瘤学上的利与弊。
原名：The Pros and Cons of Incorporating Transcriptomics in the Age of PrecisionOncology
期刊：JNCI-JOURNAL OF THE NATIONAL CANCER INSTITUTE通讯作者：Victor T. G. Lin医学博士、Eddy S. Yang医学博士通讯作者单位：阿拉巴马大学伯明翰分校奥尼尔综合癌症中心、休·考尔精密医学研究所放射肿瘤科和医学部血液肿瘤科DOI号：10.1093/jnci/djz114/5511408针对个体患者和肿瘤的特性，癌症的治疗继续向个性化疗法发展。在精准肿瘤学方面的发展证明了在鉴别和预测反应生物标志物的重要性。直到最近，大多数的生物标志物都是使用免疫组织化学法进行蛋白质表达或单基因分析来鉴定的。随着高通量测序技术（NGS）评估肿瘤组织和“液体活检”技术的快速发展，基因组生物标记物的鉴别尤其是在非小细胞肺癌领域是目前的常用方法，许多疾病根据生物标志物从而被期待个性化治疗。尽管目前取得巨大进步，但也很明显，仅使用基因组生物标志物是不够的。目前研究表明，至少有一半接受肿瘤基因组分析的患者在各方面没有发生太大的改变。这可能是由于广泛的非遗传因素导致肿瘤的发生和发展。有些人建议下一步是使用转录组来定义新的反应生物标志物用来靶向治疗。最近，WINTHER试验的结果被发表，该试验结果表明应用转录组学的匹配率高于单纯使用基因组高通量测序技术（NGS）。在这篇综述中，讨论了精准肿瘤学的复杂性，并评估在指导癌症治疗的生物标志物发展的历史背景下，将转录组学数据整合到精准肿瘤学框架里的证据。目前关于精准肿瘤学最主要的争论是围绕着患者投入高昂的成本进行检测和针对性治疗是否能得到更多的利益。反对者指出了诸如SHIVA等证据，SHIVA是一项随机对照试验（RCT），与医生选择的化疗法相比，该试验证明基因组检测指定的非标靶向疗法没有无进展生存率（PFS）的优势。精准肿瘤学方法的支持者反对对预先指定的改变与靶向疗法相匹配的适合性进行太多的关注，这可能导致疗效被低估。与SHIVA相比，前瞻性MOSCATO-01试验是阳性的，尽管试验设计和选择的主要终点存在很大差异。对数据的乐观解读强调了这样一个事实，即接受基因组选择疗法的患者中有33%从中受益。更进一步解释是，这仅代表所有接受筛选的患者的7％，表明大约一半的接受筛选的患者没有通过研究中使用的匹配算法得到有效的改变。为了解决这个问题，最近发表的WINTHER试验的结果表明与现有的仅使用基因组高通量测序（NGS）策略相比，转录组数据的整合可潜在地提高匹配率。在不久的将来是否应广泛采用这种策略肯定会引起争议，并且有关于这种方法的成本效率的问题会被提出和解决。精准肿瘤学方法正式开始是从使用免疫组织化学法（IHC）来识别特定的反应生物标志物进而用于治疗的。该方法最早应用于在乳腺癌中，对雌激素受体（ER），孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的染色仍在进行，用以分别预测对激素阻断的响应和对HER2的拮抗。尽管这是一种较旧的方法，但IHC仍然是重要的组成部分，最近许多重要应用如基于IHC的错配修复（MMR）蛋白和程序性死亡配体1（PD-L1），这两个应用现在均用于预测对免疫检查点抑制剂的反应。原位杂交（ISH）用作IHC的替代或补充，用于评估拷贝数变异，例如以乳腺癌中HER2为例，用于鉴定基因重排和融合事件。通过ISH鉴定的融合产物被认为是精准疗法的理想靶标，因为它们通常是异常细胞所特有的，且往往是真正的致癌驱动因子。最著名的例子是慢性髓细胞性白血病（CML）中的BCR-ABL基因易位。CML曾经是最顽固的血液系统恶性肿瘤之一，预后普遍不佳，但是随着针对BCR-ABL激酶的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的开发，CML现在已成为可治疗的白血病之一，整体存活率显著提高。随着技术的不断发展，基因测序已应用于鉴定更多的靶标，并针对这些靶标开发了新药。例如，BRAF V600突变可作为BRAF和MEK抑制剂靶点，并获得了FDA批准用于黑色素瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）、毛细胞白血病和间变性甲状腺癌的治疗。与铂类化疗相比，表皮生长因子受体（EGFR）突变使晚期NSCLC对靶向药物更敏感。基因组靶点的快速大量的涌现与高通量测序（NGS）的工作效率相吻合，因此使用这个技术使，可以对多个指定目标快速完成测序。这些包含了全基因组测序（WGS），全外显子组测序（WES）和热门的靶点分析。大多数情况下是在在肿瘤组织上进行的，某些情况下会与正常组织相互比较，以区分体细胞和生殖细胞突变。除了分析新鲜的冷冻组织（FF）或福尔马林固定石蜡包埋的（FFPE）肿瘤组织本身以外，还可以对循环肿瘤细胞（CTC）和无细胞DNA（cfDNA）进行“液体活检”。基因组疗法可预先用于EGFR突变，BRAF V600突变，ALK融合，ROS1融合和NTRK融合，尤其在晚期NSCLC中特别有用。选择性TKIs抗RET融合和突变以及MET第14外显子跳跃突变的早期临床试验数据表明，这些在NSCLC和其他肿瘤类型中也具有靶向性。随着越来越多的突变被发现，越来越多的靶向药物被批准，NGS变得越来越受欢迎，尤其是先前的数据表明，选择使用分子生物的疗法可能有利于其他难治性恶性肿瘤患者。最终，医疗保险和医疗补助服务中心（CMS）决定对晚期癌症患者采用NGS来进行检测分析。然而，基因组测试所带来的好处是否与成本正相关目前仍在争论中。迄今为止，关于大量的基因组分析和因此改变的疗法所产生的结果并没有令人深刻，导致这样的原因是多种多样的，需要理解并仔细的思考，而不是直接否定这种疗法。除了在TP53，PIK3CA和KRAS中少数常见的突变之外，大多数突变都在变异频率较低的“长尾”区中，这将导致不是特别适用于RCT实验。因为为了鉴定那些低频率的突变需要筛选大量的患者，如要招募100位肿瘤突变的患者，突变率1%则需要筛选10000名患者，在罕见的恶性肿瘤中，这就变得不可能完成。因此，该方法通常是设计肿瘤诊断“篮子试验”，以便能够筛选和招募足够多的患者以得出有意义的结论。但是，这种试验设计的一个缺陷是，同一基因的不同变化（截断突变，错义突变，融合和拷贝数变异）经常合并到同一“篮子”中，这可能使结果被掩盖，因为这些变异体都是可能具有不同的相应值。另外，在匹配治疗中通常不考虑那些可能影响靶向治疗的一些共同改变的因素。相同的突变可能会导致对不同癌症中相同药物的反应截然不同，这使得结果更为复杂。例如，目前已经证明BRAF V600E突变可在多种不同的癌症类型中被BRAF和MEK抑制剂靶向抑制，但在结直肠癌中对这种抑制剂的反应性明显低于其他肿瘤。这可能是使用抑制剂时，肿瘤微环境中的恶性肿瘤和细胞信号传导之间的根本性差异导致的。像这样的案例引发了人们对篮子试验设计是否合适的担忧，尽管篮子试验的好处是肿瘤类型无关的患者是可能获得批准使用相同药物的，例如微卫星不稳定肿瘤中的派姆单抗的批准。由于符合要求的受试者的稀缺性，这些篮子试验通常事在没有独立对照组的情况下进行的，以无进展生存率（PFS）等为指标，与每个患者治疗前的结果进行自身比较。这些治疗措施在某种意义上是不完善的，因为它们取决于先前治疗和反应的实质性差异。出于伦理考虑，大多数精准肿瘤学试验都会招募较为严重的患者，这意味着得到有意义的可能性非常渺茫。但是，PFS阳性率通常被定义为比先前的治疗方案效果提高30％，即使简单地比较之前的实验也可以被认可。精准肿瘤学试验的另一个复杂性是它们只有在被测试的靶点和药物有效时才有效。例如，用高度选择性和强效的抑制剂对精心选择的靶标（例如RET或NTRK）进行药物治疗已产生了良好的结果。这与试图用mTOR抑制剂治疗PIK3CA突变导致的癌症的结果形成鲜明对比。此外，靶向疗法联合使用时可能比单药疗法更有效，尤其是在多种自变量改变的情况下，但是大多数“篮子试验”和“雨伞试验”均旨在测试单一药物。最后，当考虑到在这些试验中得到的不满意的结果时（例如NCI-MATCH试验的Taselisib和T-DM1组的不满意结果）时，请检查所有细微的变量。
如上所述，MOSCATO-01试验产生了令人鼓舞的结果：对于被基因组分析所匹配到靶点的患者，其中33％的患者PFS比率阈值达到了1.3（表1）。但这33%的患者仅占总的实验数的7%，这暴露出了一些问题。首先，在这项研究中只有199位患者（总448位患者，占比48%）接受了匹配治疗。这突出了这样的一种概念，大多数治疗效果不好的患者不太可能通过精准肿瘤学疗法获得更多的好处，尤其是试验过程太长的情况下，无论是正在研究中的药物还是没有特定的靶向药物，这也导致大量基础检验的潜在优势丧失。此外，在成功进行了肿瘤分子分析的843名患者中，只有411名（49％）具有可治疗的靶标。与其他NGS匹配试验相比，该匹配率最高（表1），更严格的匹配标准将使匹配率下降，但是可以得到更好的治疗效果。事实如此，评估分配的治疗匹配的各种算法似乎确实可以预测得分更高的结果。无论如何，使用基因组分析的匹配率只会随着新靶标的确定和新药的开发而提高。然而，因为癌症中鉴定出的突变位点的“长尾”分布，导致该领可能只有初步的进展或仅限于特定疾病。因此，最终将需要通过其他检测方式为分子图谱添加额外的细节，以提高匹配率。为了解决最后一个问题，WINTHER试验旨在评估转录组学作为基因组测序的补充，以治疗经过目前标准疗法后的晚期恶性肿瘤。在这项研究中，前瞻性地使用配对的肿瘤和正常组织的双色微阵列进行了靶向NGS和转录组分析。如果NGS没有匹配，则通过转录组分析将患者匹配。在303名接受研究的患者中，有50名（17％）没有按照方案完成的活检；107位患者（35％）根据其临床管理委员会（CMC）的建议进行了治疗，其中有69例（23％）通过靶向基因组NGS与治疗相匹配，另外38例（13％）通过转录组数据相匹配。疾病控制率指持续超过6个月的完全缓解，部分缓解和稳定疾病发生率的总和，而DNA和RNA指导的配对结果在疾病控制率上没有统计学上的显著差异（23％和32％）。NGS匹配的患者中有20％（69名中的14名）和转录组学中有26％（38名中的10名）的PFS比率为1.5，但这均未达到其预先设定的主要终点：50％和40％。尽管后期分析表明25％的患者符合PFS比率1.3的阈值，22%的患者PFS比率达到1.5，但本研究中选择1.5为阈值比1.3的标准显然更为苛刻。与其他精准肿瘤学“篮子试验”类似，该试验纳入研究的患者经过了严格的筛选，之前接受过3次治疗，其中28位（26％）接受过5次或更多次现有治疗。有趣的是，接受两种或更少的现有疗法可以预测PFS和OS值的改善，证实通过选择未进行前期多次治疗的患者能得到较好的正面结果。最值得注意的是，在本研究中，使用转录组数据可将匹配率提高50％以上，从接受治疗的患者中将匹配率从23％提高到36％。尽管与其他研究相比，基于NGS分析的匹配率较低，但在303名患者中，有158名患者（52％）接受了CMC治疗建议，侧面反映了他们的方法的准确匹配率。此外，如果仅考虑253例成功进行了肿瘤和正常组织活检的患者，则匹配率增加到62％。但是，这种方法仍然存在巨大的挑战：需要新鲜冷冻的样品以提高RNA的质量，进而可对正常组织和肿瘤组织进行活检以进行比较；而导致失败的最值得注意的两个因素是无法获得高质量的活检结果和患者自主退出治疗。由于研究的设计，一些问题仍未得到解答，例如转录组数据是否可以与基因组数据结合以改善对匹配反应的预测。在WINTHER试验结束后不久，从CoPPO结合了WES的基因组测序的试验来看，单核苷酸多态性（SNP）的拷贝数评估和冷冻样品的RNA测序（RNA-Seq）的转录组学已经被作为依据用来选择治疗方法。与WINTHER试验不同的是，CoPPO试验没有将肿瘤样品的转录组分析配对后的结果与正常组进行比较，而是通过预先设定的阈值定义了靶标阳性，IHC确认了大多数蛋白质表达，并根据RNA选择进行了临床试验。在参加该试验后接受活检的500名患者中，有352名（70％）确定了可能可治疗的靶标。并在这些患者中，有145位（41％）根据基因组数据接受了推荐的治疗，而如果使用转录组学数据，则该数字上升至207位（59％）。值得注意的是，使用转录组学数据得出的匹配率提高约50％，与WINTHER试验中看到的结果非常相似。在352例具有可操作目标的患者中，有101例（29％）接受了匹配治疗，而100例（29％）接受了不匹配的治疗。在接受配对治疗的101名患者中，有32名（32％）的PFS比率超过1.3，但未进行配对治疗的患者未报告该比率，有15（15％）位患者得到部分疗效或者没有疗效。然而，这种方法仍然存在问题。虽然活检方法比WINTHER更方便，但67例（13％）患者的活检还是失败了，只有27例（5％）患者在第二次活检成功。接受CoPPO匹配治疗的患者的客观有效率（ORR）较低（15％），但与WINTHER试验结果（11％）相当。如果将ORR计算为意向治疗人群的百分比，则两项试验的ORR都令人沮丧，CoPPO和WINTHER分别为3％和4％。但是，这两项试验均报告说，无法获得特定的靶向药物，是准确评估该方法的重大困难所在。在CoPPO中，只有29％的患者接受了匹配的治疗，而WINTHER中则为68％。此外，ORR可能不适合作为评估这些类型试验的恰当指标，因为它没有考虑到恶性肿瘤的多样性，也没有考虑到大多数受试者的病情都是严重的。尽管在与肿瘤类型无关的精准肿瘤学“篮子试验”中使用转录组数据将患者与靶向药物匹配是相对较新的技术，但mRNA检测早已在一段时间内用于指导癌症的治疗。多年来，基于组合的基因表达谱（GEP）已用于各种癌症的分子分型和风险分层。最成功的例子是使用基因标签进一步将淋巴结阴性的ER阳性乳腺癌划分为低风险和高风险亚组。当在其他癌症中已经通过GEP进行了分子亚型化时，除乳腺癌之外的其他癌症是否能够获益尚且未知。在结肠癌中，一项GEP的前瞻性试验验证了其通过该技术对患者进行分类的能力，而与临床和病理分期无关，但无法预测奥沙利铂的添加会带来什么样的好处。这些结果与乳腺癌中的结果形成鲜明对比，在乳腺癌中，前瞻性TAILORx试验能够证明GEP不仅可以预测谁可能会从化疗中受益，而且可以安全地避免不良后果。正如WINTHER和CoPPO所证明的那样，在为患者分配匹配的治疗方法时，增加大量的RNA分析确实比单纯的基因组数据具有更好的效果（表1）。此外，mRNA分析可用于鉴定NGS无法检测的剪接变异体。雄激素受体剪接变体7（AR-V7）和MET外显子14跳跃突变已被证明具有临床相关性，并且今后可能会发现更多可操作的剪接变异体。最后，鉴于无基因组改变的基因表达变化对于确定免疫细胞的功能很重要，因此目前主要研究使用基于RNA的检测方法进行免疫分析，并可能成功预测对IHC和NGS失败的免疫疗法的反应。但是，在获得更多数据之前，应将这些视为理论收益，并且此时应将基于广泛转录组分析的直接疗法用于治疗研究。在认真考虑标准用法之前，需要回答有关如何生成和解释转录组数据的许多关键问题。分析结果与相同患者的正常组织比较合适还是与同一类型其他患者的历史数据相比较更为合适？与正常组或历史对照相比，预先指定的表达阈值是否比相对表达更合适？冻存的FFPE样品能否成为转录组学的可靠RNA来源？转录信息随时间变化会发生怎样的变化？何时才有合适的时间获取用于测试的样本？无偏差的RNA-Seq是否比基于组合基因分析产生更多的预测信息？基于这些生物标志物的治疗是否可以改善预后效果？在此期间，还有许多其他机会可以对当前广泛使用的测试方式进行改进。多个供应商之间的标准化测定至关重要。相同的分析物可能有许多不同的测试方法，例如微卫星不稳定性（MSI），肿瘤突变负担（TMB）和PD-L1表达的测定，在相对常规的基于IHC的测定中也发现了不一致的结果，这是由于测试之间和实验室之间的改变以及由于肿瘤异质性导致的采样差异所致，当处理大规模并行的基于NGS的高通量分析时，这些问题变得更加复杂。大多数商业NGS报告中包含的治疗建议仅与所使用的算法和数据库一样好，并且这些建议因供应商而异，结果随时变更，且不会再另外通知客户。不幸的是，鉴于可用证据的快速发展，标准化匹配方法的出现可能性不大，这就严重限制了交叉试验的比较。随着NGS变得越来越普遍，未知重要性（VUS）变异体的数量也呈指数增长，这可能导致数据的错误解读。更复杂的是，由于克隆造血的不确定性，“活检”对于已知的癌症相关突变有可能是假阳性的。此外，经常会发现多种同时发生的变量，但大多数篮子试验仅针对其中一种改变的因素，并通常采用单一疗法。最近，I-PREDICT试验表明，当确定了多个不同的靶标时，合理可行地设计治疗方案的组合是可行的，并且有可能为先前的“篮子试验”可能会低估精准肿瘤学方法的益处”这一观点提供了证据。在认真考虑组合方法之前，非在研的或特定靶向的药物的获取是一个严重的问题，许多试验报告称只有不到一半的患者接受了与之相匹配的治疗（表1），尽管事实上大多数建议都是单一疗法。如上所述，几项不同的试验研究可能是使用免费的人口统计学数据作为治疗选择过程的一部分。众所周知，种族差异会严重影响疾病的行为和对治疗的反应。可能最重要的改进机会是让临床医生尽可能了解新的目标适应症和药物批准情况。NGS在社区环境中用于直接治疗NSCLC的最新研究得出的结论是，与常规检测EGFR和ALK改变相比，NGS没有提供统计学上显着的生存获益。但是，根据当前证据，特别是基于EGFR和ALK以外靶标的突变，在125位符合条件的治疗中，只有36位（29％）实际接受了治疗。在另一项针对晚期NSCLC的NGS研究中，对113位患者中的81位（72％）进行了基因组匹配治疗，对42位可评估患者中的36位（86％）进行了疾病控制。尽管尚无该试验的生存数据，但很明显，以最强的支持证据提高对药物靶标匹配的认识可以显着改善患者的预后。但是，鉴于新药和适应症的快速批准，这说起来容易做起来难。WINTHER和CoPPO试验验证了一项重要的原理，即可以从患者肿瘤中产生转录组数据，并用于提高基因组分析的匹配率。WINTHER中使用的方法是将FF活检组织中的mRNA表达量与来自同一患者的正常组织进行比较，可能会提高用于分配匹配项的数据质量。然而，对患者进行如此困难的活检方案在实际情况中可能是不现实的，特别是如果这些患者中的许多人在临床上正在恶化的话。使用转录组学数据提高匹配率的能力十分显著，尤其是使用基因组NGS的匹配率已达到50％左右。但是，额外成本的增加和高质量转录组数据的较难获取并不能明显提高患者的收益，因此该方法还没有为广泛采取做好准备。也就是说，这是一个值得继续研究的领域，并且随着时间的推移可能会产生更好的结果。
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