科研 | 巴西动物研究所: 通过RNA-seq鉴定的差异表达基因与Nelore牛肉脂肪酸主成分的极值
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论文ID
原名: Differentially expressed genes identified through RNA-seq with extreme values of principal components for beef fatty acid in Nelore cattle
译名: 通过RNA-seq鉴定的差异表达基因与Nelore牛肉脂肪酸主成分的极值
期刊: Journal of Animal Breeding and Genetics
IF: 1.822（2区）
发表时间:2020.4.22
通讯作者: Nedenia Bonvino Stazfuzza
通讯作者单位: 巴西动物研究所
DOI号: 10.1111/jbg.12483
实验设计
使用内洛尔牛胸最长肌作为样本，内洛尔牛24个月大时，通过常规的击晕和出血方法屠宰，死后48小时从左侧第12根和第13根肋骨之间取出胸最长肌样品（约3.0 kg肌肉和骨骼）。气相色谱仪定量测定脂肪酸（FA），共确定了5个FA总和组并选择进行进一步分析，包括：饱和FA（SFA = C10：0 + C12：0 + C13：0+ C14：0 + C15：0 + C16：0 + C17：0 + C21：0 + C22：0 + C23：0 + C24：0），单不饱和FA（MUFA = C14：1 + C15：1 c10 + C16：1 + C17：1 c10 + C18：1 c11 + C18：1 t9 + C18：1n7 + C20：1 c11 + C22：1 n9 + C24：1），多不饱和FA（PUFA = C18：2 n6 + C18：3 n3 + C18：3 n6 + C20：3 n3 + C20：3 n6 + C20：4 n6 + C20：5 n3 + C22：6 n3），omega-6 FA（ω6= C18：3 n6 + C20：3 n6 + C18：2 n6 + C20：4 n6）和omega-3 FA（ω3= C18：3 n3 + C20：3 n3 + C22：6 n3 + C20：5 n3）。表1列出了SFA、MUFA、PUFA、ω3和ω6的统计数据。将100 mg胸最长肌样本提取总RNA，用于RNA-seq试验，并对结果进行主成分分析, 使用R函数prcomp进行SFA、MUFA、PUFA、ω3和ω6的PCA，估算每个样品的PCA1和PCA2值。为了确定FA的每个总和的DEG，根据PCA1和PCA2值（HIGH_PCA1、LOW_PCA1，HIGH_PCA2和LOW_PCA2）将样本分为两个极端表型值组。最后进一步对每组进行差异表达基因分析及功能丰富分析。
表1：饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）、多不饱和脂肪酸（PUFA）、omega-3（ω3）和omega-6（ω6）脂肪酸的记录数（N）和描述性统计数据.
结果
相对于牛UMD3.1.89基因组装配的总RNA比对率为92％。共鉴定出24,616个基因（n=48）。经过质控后在46个样品中总共鉴定出12,214 个差异表达基因DEG。
通过方差分析（ANOVA）统计比较群集组（高、中和低）之间的肌内脂肪（IMF）百分比。只有MUFA（PC2）和ω3（PC1）表现出显着差异（p<.05，表2）。这些结果表明，FA组总数的大多数差异不是由于IMF的百分比所致。
表2肌内脂肪百分比（IMF，％）对饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）、多不饱和脂肪酸（PUFA）、omega-3（ω3）和omega-6（ω6）簇群之间的方差分析（ANOVA）
表3中描述了PCA分析获得的结果。PC1和PC2值用于将样本分为两个极端聚类组（HIGH和LOW），从而进行DEG分析。FA组中PC1和PC2的总和解释了超过50％的表型变异。PC1解释了表型方差的44％（MUFA）到70％（ω3），而PC2解释了表型方差的15％（MUFA）到25％（ω3）（表3）。有趣的是，ω3的前两个PC之和解释了最大的表型变异（95％，图5），并且显示DEG数最少（n=1）。此外，对于MUFA，观察到由前两个PC的总和所解释的表型变异的百分比最低（59％）（图2），也显示最大的DEG数量（n = 66）。
正如在PCA图（图1-5）中观察到的，基于PC值将高、中和低簇分类，并且每个样品显示的颜色与IMF的数量有关。在所有图中，落入“高”簇组的样本呈现绿色的样本很少，而处于“低”簇组的样本相反，其中少数样本为蓝色。因此，通过图形分析，IMF和FA总和组的百分比之间没有关系。
表3饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）、多不饱和脂肪酸（PUFA）、omega-3（ω3）和omega-6（ω6）组的主要成分1和2（PC1和PC2）的值以及差异表达基因（DEG）
图1 SFA含量的主成分分析
图2 MUFA含量的主成分分析
图3 PUFA含量的主成分分析
图4 ω3含量的主成分分析
图5 ω6含量的主成分分析
通过DAVID工具进行的富集分析确定了一个KEGG途径（bta00230嘌呤代谢）、2个GO细胞成分（GO：0005739线粒体和GO：0005737细胞质）、2个GO生物学过程（GO：0006096糖酵解过程和GO：0060348骨骼发育）和3个GO分子功能（GO：0005524三磷酸腺苷（ATP）结合，GO：0003887 DNA定向的DNA聚合酶活性和GO：0044822 poly（A）RNA结合）具有显着差异（表4） 。
表4. DAVID分析揭示的显著GO和KEGG途径（p<.05）
讨论
进行PCA是为了将表型降维表示，并描述牛肉FA轮廓的表型变异。本文观察到的表型差异可能是由以下因素决定的：（a）FA吸收的遗传变异；（b）必需MUFA或PUFA向长链FA的延伸和降解；（c）棕榈油和脂肪酸的从头合成和代谢油酸，以及（d）所有FA的沉积运送、存储/降解和氧化。
对于每个FA组，PCA聚类与IMF百分比之间都没有明显的关系，大部分差异并非归因于IMF的百分比。动物的脂肪水平会影响肉类FA的组成，而且随着脂肪水平的增加，SFA和MUFA含量的增加快于PUFA，从而降低了PUFA的相对比例，从而降低了PUFA/SFA的比例。另外选择较高的IMF百分比会影响内洛尔牛肉FA组成。这些结果需要进一步研究，以更好地了解肉牛中大理石花纹脂肪沉积的过程。
PC1解释了所有FA组中方差的最高百分比，并且显示除ω3之外DEG的数量最多。尽管在所有FA中显示了由PC1解释的表型方差的百分比最高，并且PC1和PC2的总和最高，但ω3的DEG数最少（n=1）。ω3的总和由C18：3 n3、C20：3 n3、C22：6 n3和C20：5 n3组成，其中C20：5 n3的方差系数高于C18：3 n3、C20：3 n3和C22：6 n3，这可能解释了PC1对于ω3的优势。另有研究使用与相同的数据集，但采用不同的方法也报道了SFA和MUFA的DEG数量更高。
重要GO中的糖酵解过程（GO：0006096），ATP结合（GO：0005524）和骨骼发育（GO：0060348）较为重要。糖酵解导致碳水化合物分解为丙酮酸，并产生ATP和NAD（P）H。丙酮酸可以转化为小分子，例如乙酰辅酶A。糖酵解会影响胆固醇和FA的合成。骨骼发育（GO：0060348）是与骨骼从形成到成熟的结构随时间发展相关的生物学过程。关于FA与骨骼形成之间的关系，n-3多不饱和FA在骨骼发育中起着重要作用。
在与GO相关的基因中，ACSF2、ADCY1、MAP2K3、GCK、TRIM45、CHAD和OGDH基因具有与肉品质、FA合成或代谢相关的功能。酰基辅酶A合成酶家族成员2（ACSF2）基因与FA代谢的调控有关。ADCY1基因编码腺苷酸环化酶基因家族的成员，该酶通过刺激性G蛋白偶联受体催化ATP转化为cAMP，从而导致随后的激活蛋白激酶A的调节，调节包括胰岛素分泌和脂解作用等哺乳动物的生理功能。有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶3（MAP2K3）基因编码一个参与MAP激酶介导的信号级联反应的激酶。该蛋白质是葡萄糖转运所必需的，可以被胰岛素激活。脂肪生成的过程受MAP激酶信号级联反应的调控。此外，MAP2K3和MAP2K6是密切相关的激酶，可作为特定的上游激活剂，也可能与脂质代谢和脂肪形成有关。三重基序蛋白45（TRIM45）基因编码一种调节细胞增殖、生长和凋亡的蛋白，可作为促分裂原激活的蛋白激酶途径的转录阻遏物。有研究通过转录组分析发现TRIM45基因在嫩的Chianina和坚韧的Maremmana品种中过表达。软骨粘附素（CHAD）基因编码一种软骨基质蛋白，介导分离的软骨细胞的粘附，并参与脂质代谢途径。氧代戊二酸脱氢酶（OGDH）基因编码2-氧代戊二酸脱氢酶复合物的一个亚基，通过催化2-氧代戊二酸转化为琥珀酰辅酶A和CO2而作用于克雷布斯循环，在具有IMF含量较高的动物中发现了OGDH蛋白，在控制肌肉生长和脂肪积累中发挥作用。葡萄糖激酶（GCK）编码一种单体酶，催化葡萄糖磷酸化产生6-磷酸葡萄糖，从而严格控制葡萄糖的代谢，是大多数葡萄糖代谢途径的第一步。葡萄糖激酶在葡萄糖刺激的胰脏胰岛素分泌中起着重要作用，而在肝脏中，该酶对于葡萄糖的摄取和向糖原的转化至关重要。
嘌呤的代谢（bta00230）是显著差异表达的KEGG通路。嘌呤和嘧啶是DNA和RNA分子以及脂质和碳水化合物代谢的重要组成部分。此外，嘌呤代谢产物在提供细胞内信号传导和细胞能量方面也至关重要，可以作为促进细胞生长、增殖和存活的辅助因子。嘌呤在血小板、淋巴细胞功能、肌肉和神经传递的生理中起重要作用。
关于与FA性状相关的DEG中还有KLHL25、PEMT、SREBF1和WDR3基因。KLHL25（kelch家族成员25）基因编码脂质合成的负调控因子，该调控因子与绵羊的脂肪代谢有关。PEMT（磷脂酰肌醇胺N-甲基转移酶）基因编码一种基本为肝细胞特异性的酶，通过肝脏中的三个甲基化反应，可将磷脂酰乙醇胺催化为磷脂酰胆碱（哺乳动物中最丰富的甘油磷脂）。尽管PEMT基因仅在肝脏中高表达，但在其他组织中表达低表明脂肪细胞和白色脂肪组织中脂质滴的生物合成。该基因还通过调节从肝脏到血液和周围组织的极低密度脂蛋白分泌以及富含磷脂酰胆碱的PUFA的合成，在脂质代谢中发挥作用。WD repeat 3（WDR3）基因编码属于WD-repeat家族的核蛋白，参与多个细胞过程，例如细胞凋亡、基因调控、细胞周期进程和信号转导，是参与C22：3 n-3 PUFA沉积的假定候选基因。固醇调节元件结合转录因子1（SREBF1）基因的表达主要受胰岛素刺激和调节，是最重要的转录因子之一，可以介导脂肪基因的表达并在固醇中起核心作用生物合成。SREBF1被认为是SCD（硬脂酰辅酶A去饱和酶）基因表达的主要调节因子，可催化SFA的Δ9去饱和成MUFA，并且与FA分布有关。
结论
本文介绍的结果有助于提高内洛尔牛FA谱的基础生物学机制的知识。由于只有MUFA和ω3的总和在群集组之间表现出显着差异，因此可以得出结论，对于SFA、PUFA和ω6所观察到的差异不是由于IMF百分比引起的。这项研究中确定的几种DEG与FA谱相关，可以用作内洛尔牛的分子标记，有助于改善营养和消费者的健康。
评论
因为脂肪酸（FA）的组成对牛肉的感官特性及其对人类健康的影响具有重要意义，在过去几十年中引起了人们极大的关注，但针对牛肉性状FA谱的遗传改良仍然很少。主要原因是获得这些表型的成本高，同时关于肌肉内牛肉FA谱的遗传和生理机制的信息和生物学知识有限。牛肉FA是由许多单独的FA（饱和、单不饱和和多不饱和）的组合决定的多因素性状，这使得预测牛肉品质性状具有挑战性。此外，某些特定牛肉FA的遗传变化可能会影响整体牛肉质量特性。本文利用主成分分析（PCA）用于牛肉FA的组成以产生新变量，用于通过RNA测序检测内罗尔牛的差异表达基因（DEG）分析，这些结果有助于了解内洛尔牛肉的FA所涉及的生物学机制及FA谱的分子标记。
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