科研 |Cancer Cell：单细胞RNA序列揭示小儿室管膜瘤的细胞层次结构和受损的发育轨迹
编译：小北，编辑：景行、江舜尧。
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室管膜瘤是一种异质性并具有成熟分子群的中枢神经系统肿瘤。在本研究中，研究者利用单细胞RNA-seq分析了不同分子组成和解剖位置的室管膜瘤，以研究瘤内异质性以及发育起源。室管膜瘤是由未分化群体中起始的细胞层构成，受损后分化为三个神经元-神经胶质命运特异性的谱系。室管膜瘤中预后良好的主要是分化的细胞，而恶性的群体主要是未分化的细胞群体。该转录组特征与患者的存活率相关，并揭示了靶向治疗的分子依赖性。综上所述，该分析揭示了与生物学和临床行为相关室管膜瘤的发展层级。
论文ID
原名：Single-Cell RNA-Seq Reveals Cellular Hierarchies and Impaired Developmental Trajectories in Pediatric Ependymoma
译名：单细胞RNA序列揭示小儿室管膜瘤的细胞层次结构和受损的发育轨迹
期刊：Cancer Cell
IF：26.602
发表时间：2020年7月
通讯作者：Mariella G. Filbin
通讯作者单位：海德堡大学医院
DOI号：10.1016/j.ccell.2020.06.004
实验设计
结果
研究者致力于从不同分子群体和解剖位置的EPN组织中生成单细胞转录组数据。研究者利用全长的单细胞RNA-seq技术分析了18个EPN患者中20个新鲜的外科手术肿瘤样本、8个病人源性的细胞模型以及两个病人源性的异种皮移植(PDX)模型（图1A）。四个细胞模型与新鲜的患者肿瘤匹配（表S1）。此外，速冻的EPN组织（n = 14）包括在单核RNA-seq(snRNA-seq)分析中（图1A）。研究者通过每个样本的DNA甲基化进行了分子群体的分析（图1A）。共计分析了74,927单个的肿瘤细胞/核，scRNA-seq绘制的5,232细胞图谱通过质控，每个细胞检测到的中位数为4,652个基因。SnRNA-seq获得了另外2,137/67,420细胞核(Smart-seq2/10X Genomics)，每个核检测到的中位数为3,072/3,089个基因。
为了区分癌细胞和非癌细胞，研究者根据scRNAseq/ snRNA-seq的数据推断了全基因组拷贝数突变（CNAs）（图1B）并且与非癌对照组比较了CAN图谱。在大多数样本(n = 24/28)中检测到了大范围的CNAs并且与DNA-甲基化数据源性的进行匹配。CNAs包括获得特征染色体1q (PF-A, ST-RELA)以及其他典型的EPN-CNAs包括Chr6q缺失(PF-A, PF-B, ST-中线) 、Chr22单染色体性以及Chr5p获得（PF-A和PF-B）。接下来研究者将所有的样本依据它们的转录图谱进行聚类（图1C）。一些细胞集簇缺乏CAN并且对正常细胞类型特异的标记基因高表达，包括小神经胶质细胞(n=296, eg, CD14,FCER1G, CSF1R)、T细胞(n=111, eg, CD3E, CD4, CD8A)、少突胶质前体细胞(OPCs) (n=101, eg, OLIG1,APOD, PDGFRA)、少突胶质细胞(n=149, eg, MBP, PLP1,MOG)以及内皮细胞(n=153,eg, IFITM1, CAV1, TM4SF1)。那些细胞被认为是非癌细胞并且在下游分析中排除。
因此，这两种方法都能将细胞分为癌细胞和正常的亚群。通过Smart-seq2在所有肿瘤样本中总共分类了87.8%的细胞。
图1 人类EPN单细胞转录组的分类 。(A) 新鲜/冷冻患者样本(n = 28)、患者来源细胞模型(n = 8)以及PDXs (n = 2)的EPN数据库中临床和分子细节，对每个样本进行scRNAseq，匹配对(n = 5)用上标符号表示。(B) 根据scRNAseq（上）/ snRNA-seq（下）的数据中100个基因的相对表达推断全基因组拷贝数突（CNAs），每一排对应一种细胞，按照肿瘤顺序排列并且在每个肿瘤内依据CAN图谱进行聚类。(C) 对scRNA-sq和snRNA-seq来源的所有细胞进行tSNE分析，依据CNAs以及与非癌细胞群体（T细胞、少突胶质前体细胞[OPC]、少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞）表达图谱的相似性标注不同的颜色。
2 后颅窝EPN由多个分化的以及未分化的肿瘤细胞群体构成
为了描述PF-EPN，研究者利用14个PF患者的肿瘤作为原发性群体并且利用另外4个样本(WEPN1/Dia, WEPN1/Rec, WEPN20/Dia, WEPN20/Rec)对肿瘤复发进行确定和研究（图1A）。BT1313和BT1334两个样本大多数包括免疫细胞因此也排除了非负矩阵分解分析。研究者通过NMF确定了复发的转录程序并且将它们合并为9个元程序（图2A）。此外研究者还利用了基于图形的聚类分析。两种方法获得了高度重合的聚类，证实了能够确定细胞亚群的基因特征。研究者检测了已知细胞类型特异性的标记物基因的基因特征，并将它们与人类和鼠发育以及成熟脑细胞相关数据组整合，利用GO分析进行功能注释，发现有两个元程序与细胞周期基因密切相关并且最终定义为PF-S时期(eg, TYMS, PCNA, MCM2/4/5/7)以及PF-G2M时期(eg, CDC20, CCNB1, PLK1)（表S4）。研究者将这些元程序中分值最高的细胞解释为细胞周期的细胞群体，大多数无一例外的发生在PF-A样本中。另外两个元程序的更接近成熟的细胞类型：表达纤毛发生标记物的PF-室管膜样细胞（如DNAAF1,DNAI2, RSPH1），并且在鼠相关数据库中与分化的室管膜细胞类型具有相同的全转录组程序（表S4）。PF-室管膜星形的特征包括星形胶质细胞经典的标记物基因(eg, AQP4, ALDOC,S100B, GFAP)，并且在人类和小鼠的数据库中与星形胶质细胞密切相关。另外三个元程序代表未成熟的干细胞样细胞、神经元或者神经胶质细胞的前体。PF-神经元干细胞样程序(PFNSC-样)与转录活性和干性相关（eg，FOS, LGR5, ZFP36, EGR1, JUN），这编程了大量未成熟的细胞，可在讲来作为正常细胞谱图可用。PF神经元前体样细胞包括神经元相关的基因(STMN1/2/4, SOX4/11, ELAVL4, L1CAM)，而PF-神经胶质前体样程序与神经胶质的早期相关(FABP5, BCAN)。还有两个元程序被确定为代表不同细胞代谢/免疫-反应状态并且包含与糖酵解(PF-代谢, eg., PGK1, GAPDH, PFKP)以及免疫效应过程（PF-免疫反应，eg, IFITM3, HLA-C, C4B）密切相关的基因。在PF-代谢程序内，一些GO富集的条目也提示缺氧反应。
为了进一步确定元程序的牢固性，研究者将三个冻存的PF-A样本与已经分析过的新鲜样本进行匹配通过10X Genomics构建了snRNA-seq，并且发现了相似的基因程序。此外，元程序在PF-A PDXs和体外细胞模型中也可部分重复。然而，PDX模型最接近新鲜病人组织中原始的细胞状态。
研究者接下来在所有PF肿瘤中比较了scRNA-seq图谱（图2A、2B）。结果发现，PF-A肿瘤中最具侵袭性的分子群在每个肿瘤中包含一个高复杂性的元程序，并且富集分化最小的细胞（p < 0.001）(图2C )。有趣的是，增殖的细胞被限制在三个未分化的亚群中：PF-NSC-样, PF-神经元-前体-样以及PF-神经胶质-前体-样。相反，更阳性的分子群组PF-B和PF-SE的样本都无一例外的包含增殖能力最小的、表达PF-室管膜样以及PF-室管膜星形细胞样更加分化的细胞群体（图2C）。
研究者继续研究了调节这些程序的潜在转录因子（TFs），结果发现FOXJ1靶向的基因更倾向于在PF-室管膜样亚群中表达（p < 0.001），不是PF-B特异的但是是纤毛原性程序的标记物，并且在PF-A亚群中也观察到了室管膜的分化（图2C、2D）。
此外，研究者通过单细胞调控网络SCENIC集簇分析全面推断了TF调控网络。在研究者的数据组中确定的TF调节子有超过一半高度活化的在之前的报道中发现。另外，SCENIC也提示在PF-室管膜-样元程序内有其他的TF调节子，包括RFX2和TP73，两个在纤毛发生中发挥重要作用（图2E）。PF-NSC-样细胞TF的特征包括JUN, FOS, ATF3,这几个基因也是亚群中高表达的基因（图2E）。在PF-NSC-样细胞中其他具有高活性的TF调节子有SRF和JDP2，两者在抑制分化并且诱导多能性中发挥重要作用（图2E）。PF-神经元-前体样程序也表现出选择性的TF特征，包括NEUROG1/2以及ARID3A（图2E），能够参与调节神经发生并且促进致瘤性干性。最后，PF-神经胶质-前体样细胞表现出TF的特征，包括OLIG2，Lastly,与早期神经胶质命运的确定是一致的，提示这一元程序的前体样状态（图2E）。
接下来研究者旨在PF-A样本中通过利用RNA原位杂交(RNAISH)确定完整肿瘤组织中元程序的表达。在PF-A肿瘤切片中，对显著基因分析发现PF-室管膜样（CD36）和PF-NSC样（ATF3）标记物互斥表达，并且是在某些程度上细胞的空间集簇表达对应的程序（图2F）。在研究者匹配的肿瘤对中确定scRNA-seq的数据，研究者通过RNA-ISH发现与上述局部复发的组织MUV021相比，在转移复发的PF-A肿瘤组织MUV038中PF-NSC样特征的细胞表达上升而表达PF-室管膜样程序的细胞表达降低（图2F）。
总之，PF-EPN细胞的scRNA-seq分析发现特异的TF调节回路驱动了不同肿瘤细胞亚群。未分化的NSC样以及早期神经元-前体样肿瘤细胞类型在侵袭性的PF-A肿瘤中富集，而分化的室管膜样细胞类型主要在诊断良好的PF-B以及PF-SE肿瘤中发现。
图2 PF-EPN肿瘤内的异质性。(A) 2773个肿瘤细胞中前30个基因每个PF元程序的相对表达；(B) 所有新鲜PF肿瘤细胞中tSNE点图，依据分配的PF元程序标注不同的颜色；(C) 每个样本中每个元程序的相对频率，依次展示为PF-A, PF-B以及PF-SE。MUV021 vs MUV038:PF-室管膜样细胞(p = 2.9×10-112)以及PF-NSC样细胞(p = 3.1×10-123)；(D) PF-EPN元程序中FOXJ1靶基因表达的数值；SCENIC分析PF-EPN亚群特异的TF平均相对活性；（F）与scRNA-seq样本对应，经福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织切片上PF-NSC-样（ATF3）标记物与PF-室鼓膜样(CD36)标记物的RNA原位杂交。箭头和星号分别代表ATF3或者CD36阳性的细胞，标尺为20 mm。
3 癌症分化的轨迹具有诊断的效应并且可能作为治疗的靶向
研究接下来致力于通过RNA速度测定PF-EPN细胞内的分化轨迹。本研究的PF scRNA-seq的数据表明在PF-NSC样细胞中出现细胞等级并且有三个主要的轨迹：大多数细胞沿着室管膜星形细胞向室管膜样细胞分化（图3A）。第二个轴线发生在向神经胶质前体样细胞，表达某些放射状神经胶质细胞和早期神经胶质谱系标记物的基因。第三个是包含PF-神经元前体样细胞的最小细胞群体，表达早期神经元命运的基因，但潜在的发育轨迹与所有的PF肿瘤是一致的。
研究者接下来评估了131例存活的PF-EPN中整体RNA表达矩阵中转录特征的诊断效应。通过高或低水平的PF-室管膜样特征的分离发现高表达这一程序的肿瘤是PF-B或者预后良好的PF-A亚群（图3B）。为了支撑这一发现，PF-室管膜样特征更显著的在整体存活期(OS)、无进展存活期(PFS)病人以及PF-A病人中分离（图3C）。这一结果由多元COX回归分析证实在OS和PFS中PF-室管膜样特征可作为独立的诊断因子。此外，低表达PF-室管膜样特征的PF-A案例中死亡率7.3倍升高。考虑到PF-神经元前体样特征，PF-B肿瘤集簇全部在“低”表达的矩阵，而PFA肿瘤被分离在“高”和“低”集簇中。在PFN神经元前体样程序中高表达的EPNs具有更差的OS，甚至只包括PF-A的病人（图3D、3E）。相反，所有剩余的程序，除了矩阵分为“高”和“低”表达的群体，与病人的结果并不相关。此外，研究者发现在室管膜分化和更高年龄的EPN病人之间存在正相关，而PF-神经元-前体特异的/PF-NSC特异的标记物和年龄之间负相关。
研究进一步检测了1q获得的肿瘤样本是否在未分化的程序中富集，观察到分化的PF-A室管膜样细胞数量更少而干细胞样PF-神经胶质前体样细胞的数量升高。分析的结果受小的样品体积(n = 7)以及病人间高的异质性限制。
由于在EPN参与中肿瘤复发代表主要的临床问题，研究者在诊断/早期复发与晚期复发样本中研究了三个匹配的PF-A对。研究者发现诊断时主要分化的PF-室管膜样以及PF-A室管膜样细胞向复发时未分化的PF-NSC样、PF-神经胶质前体样细胞以及增殖细胞的转变。
为了改进未来治疗的方法，本研究探究了靶向潜在的信号通路以及确定表达特征的特异生物标记物。整合了细胞群体特异的基因与药物基因相互作用数据库（(DGIdb），将药物干预可行的靶基因优先排列。对于PFN-神经元前体样亚群，这些分析提示包括表观调节因子HDAC2, DNMT3A, BRD3；信号通路相关的基因PIK3R3, MAP4K4, and MAPK6；微管相关的基因TUBA1A, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB3；以及活化素受体基因ACVR2A、ACVR2B具有药物脆弱点（图3F）。PF-神经元前体样细胞也表达ABCC5，在血脑屏障中能够转运一些抗癌药剂的一种ABC转运体。PF-神经元前体样程序中DGIdb谱系显著富集的GO条目功能网络图谱发现激酶活性相关的机制以及神经元发育过程中L1CAM调节的信号通路富集（图3G）。作为功能确定的第一条准则，研究者在表达这一基因的两个PF-A细胞模型中通过帕比司他抑制HDAC2，确实发现细胞存活率显著降低，并且次生球层的形成受到抑制。
成功的PF-NSC-样程序包括Wnt信号通路调节因子LGR5、抗凋亡基因MCL1以及肿瘤干性相关的基因作为潜在的药物脆弱点（图3H）。PF-NSC样亚群的功能网络图谱支撑了这些结果并且同样富集的信号通路聚集在LGR5信号通路、FOS/FOSB/JUN/JUNB调节的转录因子活性、MCL1-依赖的抗凋亡活性以及细胞周期的调节，在这一亚群中也反映了一个高比例的增殖活化细胞（图3G）。的确，LGR5在PF-NSC样细胞中显著上调（图3I），并且在siRNA调节的LGR5敲除实验能够在LGR5表达病人谱系的PF-A模型VBT96中显著抑制细胞球的形成（图3J）。
因此，研究者发现PF-EPN中单细胞等级反映了生理上停滞的分化轨迹，从NSC样肿瘤细胞群体到神经元前体样、未成熟神经胶质样以及更加分化的室管膜样种系。这些转录状态可作为已建立分子组中稳健的风险预测因子并且提示未来治疗策略中是第一个亚群特异性并且靶向分子肿瘤依赖。
图3 PF-EPN中肿瘤细胞分化轨迹以及它们的诊断和治疗相关性。（A）PF元程序RNA速度推算，每个点代表一个细胞，依据对应的元程序将细胞标记不同的颜色，箭头代表所推测细胞命运的速度；（B）（C）依据整体mRNA表达数据，PF-室管膜样元程序中前30个基因的表达水平对PF和PF-A EPN的整体生存期进行分类；（D）（E）依据整体mRNA表达数据，PF-神经元前体样元程序中前30个基因的表达水平对PF和PF-A EPN肿瘤的整体生存期进行分类。log-rank检验证实显著性水平；（F）饼图展示通过整合PF-神经元前体样元程序的显著基因与DGIdb分析，得到的靶向治疗候选基因；（G）PF-神经元前体样以及PF-NSC样元程序中DGIdb富集分析得到的GO条目；（H）饼图展示通过整合PF-NSC样元程序的显著基因与DGIdb分析，得到的靶向治疗候选基因；（I）在PF-EPN元程序中Log-LGR5的转化表达；（J）使用siLGR5或非靶向siRNA (siScr)转染PF-EPN细胞模型VBT96 48 h和72 h后相对球形面积。
4 ST-EPN是由多样的且分子组特异的细胞类型组成
研究者分析了8个ST-EPN样本，包括ST-RELA (n=5)、ST-YAP1 (n=1)以及两个随后复发的手术样本，通过甲基化图谱划分ST-EPN病人(BT1030, CPDM0785)为PFA（图1A），也将这些样本作为ST中线。总之，研究者在所有NMF和基于图表聚类定义的所有病人中检测了10个元程序（图4A-4C）。两个元程序与细胞周期基因密切相关并且最终定义为ST-S期(eg, KIAA0101, MCM2-7,PCNA)和ST-G2M期(NUSAP1, CDC20, CDK1)。那些循环中的细胞全部无一例外的发生在STRELA肿瘤中。更重要的是，一个更加分化的元程序ST-室管膜样被纤毛发生的标记物描述(eg, SPAG6, LRRC48, DNAAF1)，在相关的数据库中代表成熟的室管膜细胞并且与PF-室管膜样细胞表现出很高的转录重叠。有趣的是，匹配的ST-中线对在后者(CPDM0785)的分化亚群中降低（图4C）。STRELA能够表达另外两个代表未分化前体细胞的元程序，然而ST-YAP1肿瘤细胞不能。在ST-RELA中未分化的程序能够与人类和小鼠相关数据库中放射状胶质细胞高度匹配。这一元程序只限制在PF-EPNs中与PF-NSC样细胞重合，并且最终定义为ST-放射状神经胶质样细胞。在ST-EPN中第二个未分化的程序在ST-神经元前体样中表达确定早期神经元命运的基因(STMN2/4, ELAVL4, NEUROD1)。另外两个程序在ST-RELA肿瘤中存在但是在STYAP1肿瘤中不存在，并且表达干扰素信号重要的基因(ST-干扰素响应, eg, ISG15, IFI6/27/30, IFIT1/3)，或者与糖酵解以及缺氧密切相关(ST-代谢, eg, LDHA, ENO2, PGK1)。另一个程序仅在ST-RELA肿瘤MUV043中发现，与结缔组织发展和细胞外间质组织相关(eg, DLK1, PCP4, ACPT)（图4C）。ST-中线以及ST-YAP1肿瘤都特异的表达各自的元程序，分别被命名为ST-中线以及ST-YAP1。类似于PF肿瘤，通过10 X Genomics匹配的病人组织的snRNA-seq总结了通过scSmart-seq2在新鲜病人组织中确定的表达图谱。此外，ST-RELA PDX和神经球状细胞模型源的元程序与黏连的ST-RELA细胞培养相比更能代表病人的转录程序。
为了确定C11orf95-RELA融合基因的潜在下游靶基因，研究者首先在所有EPN亚群中获得了“野生型RelA”和“C11orf95-RelA融合”的靶基因的结合体。这些基因在所有ST-RELA亚群中表达并且在ST-代谢、ST-干扰素响应以及STRELA-突变程序中中度富集。通过C11orf95-RELA融合体特异活化的基因具有相似的表达图谱。
第二，研究者进行了SCENIC分析获得了更加广泛的RELA靶基因列表，以检测亚群间的TF活性。这提示ST-RELA肿瘤中在所有七个程序中RELA TF的活性很高，而YAP1-和ST-中线特异的程序中RELA信号通路的活性很低。此外，SCENIC分析提示ST-室管膜样、ST-中线、ST-YAP1、ST-RELA-突变体以及ST-神经元前体样亚群中TF特征不同（图4D），后者与PF-神经元前体样细胞表达NEUROG1。相反，ST-室管膜样细胞由TF网络(RFX8, SRY,CAT, PAX8, GATA1)描述，与PF-室管膜样中不同（图2E），也反映了TF活性的区域特异性。总之，这些数据提示在ST-RELA所有亚群中RELA靶向基因表达的首要作用，但提示转录多样性导致多样细胞状态是不依赖于C11orf95-RELA活性的。
总之，ST-EPN的scRNA-seq说明STRELA肿瘤是高度增殖的、未分化的放射状神经胶质样或者有限分化程序的神经元前体样细胞（图4C）。ST-中线以及ST-YAP1 EPN组甚至表现出更低的转录复杂性，并且未分化的以及增殖的细胞比例相对更少，这些分子ST-EPN亚群反映出更轻的病程。
5 ST-EPN元程序预测病人的生存期并且能够作为治疗的靶向
研究者再次利用RNA速度评估了ST-RELA肿瘤内潜在的分化轨迹，在ST-EPN中发现肿瘤内和肿瘤间具有高度的异质性。如上图描述的，ST-RELA肿瘤内大部分细胞很少分化为前体样细胞，包括放射状神经胶质样和神经元前体样细胞，而很少的细胞表达分化的程序（如ST-室管膜样）。结果，RNA速度在未分化的群体中没有一个清晰的发育层次。
研究者接下来聚集了大量的 RNA-seq 患者群体(n=30)为高表达和低表达的群组，探究了ST-EPN元程序在危险层级中的重要性。尽管分化的ST-室管膜样特征仅在研究者ST-EPN scRNAseq群体的一小部分出现，研究者在整体表达数据库的一些肿瘤中发现这一转录程序的分值很高。与PF-EPN类似，依据高vs低的ST室管膜样特征的分离说明高表达这一程序的肿瘤显著表现较好的预测（图5A）。研究者也分别在ST-RELA肿瘤中证实（图5B）。
为了确定ST-RELA中药物的脆弱点，研究者将DGIdb与特异性的基因整合，结果发现了可作为靶向的基因CCND2, HDAC2, EFNA5（ST-神经元前体样）（图5C）；FGFR3, IGF2, WNT7B（ST-放射状神经胶质样）（图5D）；RPS6KB2、EGFL7（ST-RELA突变体）（图5E）。DGIdb功能网络的成功绘制提示ST-放射状-神经胶质样细胞与激酶活性相关的过程相关，而ST-神经元-前体样基因在调节轴突导向的信号电路中发挥重要作用（图5F）。ST-RELA突变体程序包括主要的多药外排转运体ABCB1的机制（图5F）。
正如功能确定实验验证的，研究者发现对ST-放射状神经胶质样程序标记物FGFR3的瞬时、siRNA介导的KD（图5D）显著损害具有细胞球形成能力的FGFR3表达的VBT242细胞（图5H）。利用FGFR抑制剂多维替尼能够有效抑制VBT242细胞的存活。同样临床上支撑的ALK抑制剂也能抑制IGF2/IGF1R轴线，ST放射状神经胶质样细胞的另一标记物，有效降低这一模型中的细胞存活。此外，利用帕博西尼（靶向CDK4/6-CCND2分子）和赛立替尼（靶向IGF2/IGF1R轴线）抑制剂同时靶向ST-神经元前体样以及ST-放射状神经胶质样程序导致VBT242细胞的存活显著降低（图5I），尽管帕博西尼可单独作为主要抑制细胞增殖效应的药剂。
总之，研究者的结果提示未分化的ST-RELA放射状神经胶质样肿瘤细胞向分化的增殖失活细胞的有限转变可能构成了EPN群组侵袭性的基础。此外，某种界定的转录图谱具有诊断的价值，甚至能够在前期临床试验后定义分子脆弱性。
图5 ST-EPN亚群中存活和潜在的脆弱点
图5 ST-EPN亚群中存活和潜在的脆弱点。（A-B）依据整体RNA表达数据，ST-室鼓膜样元程序中前30个基因的表达水平对ST和ST-RELA肿瘤的整体生存期进行分类。log-rank检验证实显著性水平；(C–E)饼图展示通过整合ST-神经元前体样、ST-放射状胶质细胞以及ST-RELA变异的元程序与DGIdb分析，得到的靶向治疗候选基因；(F) 在ST神经元前体样、ST放射状胶质瘤以及ST-RELA变异的元程序中DGIdb富集分析得到的GO条目；(G) 在ST-EPN元程序中Log- FGFR3的转化表达；(H) 使用siFGFR3或非靶向siRNA (siScr)转染ST-EPN细胞模型VBT242 48 h和72 h后相对球形面积；(I) CellTiter-Glo实验证实帕博西尼和赛立替尼抑制剂联合处理72h后VBT242细胞的存活。
6 黏液乳头型EPN是由室管膜样细胞和代表PFNSC样群体的未分化细胞构成的
通过对颅内EPN的分析，研究者通过scRNA-seq分析了脊髓粘液乳头状EPN(SP-MPE)的样本并且检测了肿瘤细胞内四组亚群（图1A、6A、6B）。SP-室管膜样细胞在参考数据组中与分化的室管膜细胞匹配，并且代表PF-室管膜样以及ST-室管膜样程序。有趣的是，未分化的SP-前体样群体具有PENSC样细胞的一些标记物基因，提示这些肿瘤的起源是类似的细胞。第三个命名为SP-免疫反应的元程序有在免疫学过程中重要的基因(eg, HLA-DRA/DPA1/DRB1/DMA, CD74, CD14, B2M)，但是并未与发育的或者成熟的脑细胞可信的匹配。大多数SP-MPE肿瘤BT1678表达这一SP-免疫反应程序，SP-MPE肿瘤MUV068表现出高度的元程序多样性，并且表达未分化的SP-前体样以及相当分化的SP-室管膜样特征。第三个特征并未在BT1678中发现，成为SP-突变型（图6C）。
研究者进一步确定改了之前报道的转录因子HOXB13的高表达特异的发生在SP-MPE中（图6D）并且不依赖年龄（图6E）。研究接下来在MUV068的SP-MPE组织切片中进行了RNA-ISH并且在所有肿瘤细胞中证实该标记物的表达，而只有一个小亚群的细胞对于SP-前体样标记物JUNB以散点的方式呈阳性染色（图6F）。重要的是，在发育小鼠胚胎中对HOXB13表达的空间分析发现其表达局限于大部分脊髓尾部，SP-MPE的主要定位位置（图6G）。
总之，SP-MPE简要概括了发育过程中在空间上受限于脊髓尾部，并且病人具有相同的转录程序而与年龄无关。
7 元程序对比揭示了EPN的特异性以及泛神经胶质瘤的共有特征
接下来研究者评估了所有EPN组中转录程序的相似处和差异，研究者对Smart-seq2数据库中所有4401个肿瘤细胞中肿瘤组特异的元程序(n = 23)进行评分，元程序表达分值之间的配对关联发现元程序的五个集簇与所有EPN组高度相关并且相似（图7A）；细胞周期相关的程序（S和G2M期）在PF和ST样本中也表现出高度的相似性。同样，在ST、PF以及SP肿瘤中确定的室管膜样程序也表现出配对的相关性（平均r = 0.92），提示在所有解剖位置室管膜样细胞的分化程序。在未分化的细胞群体，在PF-和SP-EPN(r = 0.92)中确定了相似的前体样群体，但是与ST-RELA或者STYAP肿瘤中干细胞样群体不同。重要的是，在PF-A和ST-RELA样本中发现的两个神经元-前体样群体高度相关(r = 0.89)，提示在两个次优的EPN组中相关神经元样肿瘤细胞的轨迹。在PF-A和ST-RELA中的代谢群体也高度相关(r=0.72)，提示在糖酵解和缺氧相关过程(LDHA, PGK1,HK2, PGAM1)中有活化的亚群存在。总之，研究者发现在PF-EPN和ST-EPN中未成熟的肿瘤细胞表现出有限的转录重叠，说明一个时空特异性的EPN干细胞生态位，尽管它们能够提高相似分化的室管膜样肿瘤细胞。
由于之前报道的在小鼠模型中EPN促癌基因在晚期神经胶质样肿瘤生成过程中的角色，研究者进一步利用人类肿瘤衍生的scRNA-seq数据将EPN的发育层次与其他晚期神经胶质进行比较。研究者首先将所有EPN元程序与之前在弥漫性内源性脑桥胶质瘤(DIPG)和神经胶质瘤（GBM）等其他晚期神经胶质元程序相关联（图7B）。研究者同样在Smart-seq2数据库中对这些元程序进行了评分并且分析了不同肿瘤样本中元程序的成对关联（图7B）。有趣的是，研究者发现在EPN中神经元前体样程序与GBM中神经元前体样细胞程序之间高度相似，提示在这些肿瘤类型中类似的异常神经元谱系基因表达（图7C、7D）。此外，在PF-EPN和ST-EPN中两个代谢的程序与GBM中Mes-2程序高度相关（图7E、7F），提示缺氧相关的应答可作为这两种肿瘤的共有特征。相反，在PF-EPN中发现的未成熟的PF-NSC样特征与GBM中NPC1（图7G、7H）或者NPC2（图7I、7J）或者DIPG中的任意程序都具有很小的重合，说明了不同细胞的起源。此外，在EPN中发现的室管膜样程序并不代表GBM中任意成熟的程序，说明这一程序可作为EPN特异的转录特征。相反，在EPN中发现的中间物语PF-A室管膜样程序与DIPG和GBM中的两个星形胶质细胞样程序高度相关。
总之，这些数据说明在所有分子群以及与其他晚期神经胶质相比较EPN特征，转录程序部分相同，同时也提示在人类CNS发育过程中不同细胞的起源或者不同时空时间点将会导致晚期神经胶质的不同层次。
结论
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