科研| Environmental Science & Technology:单细胞测序揭示双酚A对斑马鱼胚胎发育的异质性影响

编译:秦时明月,编辑:夏甘草、江舜尧。

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导读

胚胎期是双酚A(BPA)胁迫的敏感时期。然而,胚胎的发育是一个高度动态的过程,细胞亚群不断变化。BPA对鱼类胚胎细胞发育过程中的异质性影响尚不清楚。本研究应用单细胞核酸测序的方法分析了BPA胁迫对64683个斑马鱼胚胎细胞在受精后8、12和30小时转录组异质性的影响共鉴定出38个细胞亚群,其中16个细胞亚群的基因表达谱被BPA显着改变。在8hpf时,BPA主要影响胚胎的外层细胞群,如神经板边缘细胞和包膜层细胞。在12和30hpf时,神经系统的形成和心脏的形态发生受到干扰。在斑马鱼幼体中,神经板边缘、神经嵴和神经细胞分化突起的改变导致神经发生的增加。在前脑、中脑、神经元中,与细胞分裂、DNA复制和修复相关的通路发生改变。此外,BPA还改变了心肌细胞中TGF β信号和心管形态发生,导致斑马鱼幼体心跳减慢。本研究在单细胞水平上全面了解了BPA对鱼类胚胎发育的毒性。

论文ID

原名:Single-cell sequencing reveals heterogeneity effects of bisphenol A on zebrafish embryonic development

译名:单细胞测序揭示双酚A对斑马鱼胚胎发育的异质性影响

期刊:Environmental Science & Technology

IF:7.864

发表时间:2020.07

通讯作者:吴兵

通讯作者单位:南京大学

DOI号:10.1021/acs.est.0c02428

实验设计

成年斑马鱼受精后立即收集胚胎,然后进行BPA处理。然后,将BPA原液在E3培养基中稀释至最终浓度(100μg/L)。将斑马鱼胚胎分别暴露于2.5hpf~8 hpf、12 hpf和30 hpf中,每个样本收集40个胚胎进行scRNA-seq以及数据分析。然后进行培养液和斑马鱼胚胎中BPA的定量测定,之后测定发育毒性,包括在暴露于BPA之后,斑马鱼胚胎和幼体的死亡率、孵化率、心跳、体长情况。最后分析了转基因斑马鱼在100μg/LBPA处理下的神经发育。

结果

1 BPA在培养基和斑马鱼胚胎中的浓度

浓度为100μg/L的BPA在8、12和30hpf时的检测浓度分别为108.5±2.4、115.2±3.4和96.7±5.5164μg/L。BPA浓度与实际浓度之间的偏差小于20%。在8hpf、12hpf和30hpf采集的斑马鱼胚胎中,BPA的浓度分别为42.9±1.5、42±0.6 3和49±1.2 7μg/kg。对照组斑马鱼胚胎中未检测到BPA。

2 斑马鱼胚胎发育过程中的细胞群

8hpf、12hpf和30hpf时,在斑马鱼胚胎期分别获得20430、27376和16777个细胞(包括对照组和BPA组)。在8 hpf时,分别有18和15个明显的基因聚类(图1A和1B)。根据标记基因,这些细胞群被注释为11个细胞亚群。其中,对照组和BPA组共有10个细胞群,分别属于外胚层(6个细胞群)、中胚层(3个细胞群)和内胚层(1个细胞群)。在12hpf时,对照组和BPA组分别发现16和21个t-SNE簇 (图1A和1B)。基于标记基因,上述细胞群被注释为15个细胞群。在30hpf时,对照组和BPA组分别发现13和16个t-SNE簇(图1A和1B)。两组的所有细胞群均标记为12个细胞群。

斑马鱼胚胎在8hpf、12hpf和30hpf的概貌示意图是基于本文的和已发表的结果建立的(图1C)。8hpf时鉴定的神经板边缘细胞最终分化为神经元30hpf时发现的黑素母细胞。在8 hpf时鉴定的神经板在12 hpf和30 hpf形成中枢神经系统(包括前脑、中脑和后脑)。与对照组相比,BPA胁迫增加了上述中枢神经系统中细胞的相对丰度。此外,研究人员还发现表皮细胞和包膜层细胞在30hpf时分别分化为粘液细胞和周皮细胞。

图1 斑马鱼胚胎的单细胞RNA测序。(A)和(B)对照和BPA组细胞群的t-SNE可视化。(C)通过在8、12和30hpf处的单细胞RNA测序发现的细胞亚群的概貌示意图。

3 BPA改变斑马鱼胚胎不同阶段的基因表达谱

在8 hpf时,在神经板边缘、包膜层和尾芽细胞中分别鉴定出9个、53个和5个DEG(图2A)。在其他细胞群中未发现DEG。在神经板边缘细胞中,bmp2b、cdx4和ved与其他基因表现出很强的相互作用(图2B)。Cdx4和Hesx1是前后轴模式的重要调节因子。在尾芽细胞中,TBX6位于整个主干和尾部形成所需的细胞网络的关键位置。在包膜层细胞中,GATA3和snrpd3l被认为是网络的中枢基因。GATA3对神经嵴规范做出了贡献,snrpd3l参与了Pre-mRNA剪接的调控。此外,在包膜层细胞中还发现了与缝隙连接相关的DEG (cx43.4、tuba81和tubb2b)和与信号转导相关的DEG (fnb1a和mapkapk3)。

BPA胁迫诱导斑马鱼胚胎12hpf 后鉴定的99个DEG主要是神经嵴、推测的前脑、推测的中脑和视原基细胞相关基因(图2C)。在神经嵴细胞中,控制细胞周期和有丝分裂的基因ccna2、ccnb1和mad2l1的表达被BPA改变。诱导基因(pax3a、zic2b、id3和msx3)和调控基因(snai1b、sox9b、sox10、tfap2a和foxd3)也显著上调。在神经嵴和推测的中脑细胞中发现了与细胞分裂周期相关的改变的cdca8和cdc20。基于DEG网络(图2D),cdca7a、cdc6和mcm3与推测的前脑细胞中的其他DEG显示出高度的关联。在视原基细胞中,ubc基因具有最高的连通性。在视原基细胞中也发现了与氧化应激相关的DEG,包括上调的mt-co1/2/3,mt- nd1/2/3/4和 mt-cyb。在其他细胞亚群中,hsp70.2和hsp70.3的表达上调。

在30hpf时,在四种类型的细胞群中分别发现了19、13、6和2个DEG,包括前脑,中脑,分化神经元和心脏细胞(图2E)。icn2基因在前脑、分化神经元和心脏细胞中共享。krt91、cyt1和cy1l是前脑细胞相互作用网络中的中枢基因(图2F)。与轴突生长或再生高度相关的基因tubb5、lrn1和elavl3在中脑细胞中表达下调。此外,在分化的神经细胞中,编码DNA聚合和修复酶的rrm1和rrm2表达下调。mki67233和ccnd1基因与rrm1/2基因有很高的亲缘关系,因为它们直接参与了细胞分裂(图2F)。

图2 BPA胁迫诱导斑马鱼胚胎细胞类型特异性反应。(A)在8hpf时,斑马鱼胚胎中不同细胞亚群中的DEG数目。(B) 斑马鱼胚胎在8hpf时不同细胞亚群间DEG的互作。(C)斑马鱼胚胎在12hpf时不同细胞亚群的DEG数目。(D)在12hpf的细胞亚群中DEG的互作。(E)斑马鱼胚胎在30hpf时不同细胞亚群中的DEG数量。(F)在30hpf处细胞亚群间DEG的互作。

4 BPA胁迫诱导细胞类型特异性遗传途径的改变

根据GSEA软件中的KEGG和GO功能富集分析,在8hpf时,在神经板边界、包膜层和尾芽细胞中总共改变了191条KEGG通路和176个GO分类(图3A和3B)。上述细胞共有3条KEGG通路,即趋化因子信号通路、内质蛋白加工通路和白细胞内皮细胞通路。在神经板边缘细胞中,神经突触和细胞连接主要发生改变(图3C)。在包膜层细胞,神经和内分泌系统,信号转导,先天免疫反应、细胞连接以正调控为主。此外,在尾芽细胞中,核苷酸/碳水化合物代谢、核苷酸切除修复和信号转导都是负调控的(图3C)。值得注意的是,大多数改变的信号转导途径是GTPase介导的,这与fnb1a和mapkapk3基因的上调一致。

在12hpf时,总共改变了529条KEGG通路和1064个GO分类(图3D),这些变化主要存在于假定的前脑、视原基、假定的中脑、耳盘和神经嵴细胞。19个KEGG通路和11个GO项目在上述细胞亚群中共享(图3E)。神经营养素信号通路、Pi3k-Art信号通路、Wnt信号通路和轴突引导等与轴突生长、细胞存活、分化、突触形成和轴突引导密切相关。此外,与内分泌系统以及细胞连接相关的通路也发生了改变(图3F)。除上述途径外,神经嵴细胞的核苷酸代谢和复制修复均为负调控,GO功能的富集使信号转导增加,其中TGF和Wnt信号最为丰富。在心脏细胞中,心脏形态发生和TGF β信号通路受主要影响。

在30hpf时,总共198条KEGG通路和378个GO分类集中前脑、中脑、分化神经元和心脏细胞中(图3G)。神经系统相关细胞群共有16条改变的KEGG通路和21个改变的GO分类(图3H)。BPA胁迫正向调节细胞外基质-受体相互作用,而核苷酸和碳水化合物代谢以及复制和修复是负调控的(图3I)。在中脑和分化的神经细胞中也发现了核苷酸代谢和复制修复的改变(图3I)。在心脏细胞中,神经突触、内分泌系统、ECM-受体相互作用和心管形态发生了改变(图3I)。此外,GO功能富集显示,所有细胞亚群的细胞周期和分裂都受到影响。

图3 BPA胁迫诱导斑马鱼胚胎细胞型特异性功能改变。(A)8hpf时KEGG通路明显改变的数目。(B)在8hpf时明显改变的KEGG通路的维恩图。(C)8hpf时改变的KEGG通路之间的网络。(D)12hpf的KEGG通路显著改变的数目。(E)12hpf时KEGG通路明显改变的维恩图。(F)12hpf时改变的KEGG通路之间的网络。(G)30hpf时明显改变的KEGG通路的数目。(H)在30hpf时KEGG通路明显改变的维恩图。(I)在30hpf时改变的KEGG通路之间的网络。

5 基于时间进程细胞谱系的BPA胁迫诱导神经毒性

以上结果表明,BPA胁迫显著干扰斑马鱼胚胎神经系统的发育。研究人员进一步进行了时程基因的聚类和富集分析,通过TiCoNE对分化后的神经元发育进行了深入的鉴定。来自神经系统细胞的113个基因分为5个基因表达簇。第2、4和5簇显示出统计差异。簇2中的DEG的表达随时间呈下降趋势,包括pcna、rrm1、rrm2、tuba81、cx43.4和lbr基因。这些DEG主要参与DNA的复制和脱氧核苷酸代谢过程。第4簇的DEG在12hpf时高表达,随后表达降低。大多数DEG,包括sox9a、sox10、foxd3、pax3a、zic2b、msx3和fscn1a,主要参与上皮神经嵴细胞间充质的发育和迁移。在第5簇中,DEG在12hpf处表达量最低,主要参与细胞的分裂、外胚层胎盘的形成和眼的形态发生。

6 BPA对神经元生成和心脏发育的影响

为了确定早期短期胁迫BPA是否可以引起组织水平的反应,在胁迫后去除了BPA。首先,利用斑马鱼转基因品系Huc:eGFP对神经元进行了分析,该品系可以用荧光强度来指示神经元的数量。斑马鱼胚胎在12、30和48hpf时荧光值明显增加,而在8hpf时未发现荧光值(图4A)。

BPA胁迫48和72hpf对孵化率没有影响,但降低了48和72hpf时斑马鱼的心跳(图4B)。值得注意的是,2.5-30hpf的BPA胁迫诱导了少量的弯曲脊椎(图4C)。此外,通过吖啶橙染色对凋亡信号进行了定量。结果表明,BPA胁迫可显著增加12和30hpf的凋亡细胞数量。当斑马鱼胚胎发育到72hpf时,在斑马鱼幼体的头部、耳石、心脏和脊椎区域发现了更多的凋亡细胞(图4D),这些细胞与神经系统高度相关。

图4 BPA胁迫对斑马鱼胚胎发育的表型影响。(A)斑马鱼转基因品系(Huc:eGFP)在8、12、30和48hpf处的胚胎的荧光图像。(B) BPA胁迫后的存活率、体长和心跳。(C)斑马鱼幼体在72hpf时的畸形。BPA胁迫2.5~30hpf后才发现畸形。(D)72hpf时吖啶橙染色斑马鱼幼体凋亡细胞的图像。

结论

本研究发现,在斑马鱼胚胎发育的30h内,BPA胁迫影响了16个细胞亚群的基因表达谱不良反应主要集中在与神经发生和心脏形态发生相关的细胞亚群,尤其是神经板缘、神经嵴和神经元的发育过程。与已发现的BPA对神经系统和心脏发育毒性的文献相比,scRNA-seq可以提供更准确的BPA毒性靶点,从而提高研究人员对BPA毒性过程的理解。此外,本研究还表明,对细胞群毒性的研究重点应放在化学物质的毒性靶点上,以提高细胞毒性测定的真实性。

评论

本研究深入探讨了BPA胁迫对斑马鱼胚胎发育转录组异质性的影响。参考前人研究,选择BPA胁迫浓度为100μg/L。BPA处理从受精后2.5h开始,一直持续到8hpf、12hpf和30hpf。采用10×基因组学的scRNA-seq方法测定细胞亚群及其转录异质性。本研究为BPA对斑马鱼早期胚胎发育的影响提供了基础数据,为研究BPA对鱼类胚胎发育的毒性提供了新的思路。

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