科研 | Clin. Sci.：抑制ROCK2可减轻肾纤维化和近端小管上皮细胞的代谢紊乱（国人佳作）
编译：阿温，编辑：Emma、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
在单侧输尿管梗阻(UUO)模型中，非特异性抑制Rho相关激酶(ROCKs)可以减轻肾纤维化，而ROCK1基因缺失对小鼠肾脏病理没有影响。因此，ROCK2是否在肾小管间质纤维化中起作用尚需澄清。在本研究中，我们使用了一种抗ROCK2的选择性抑制剂或遗传方法来研究ROCK2在肾小管间质纤维化中的作用。在慢性肾病(CKDs)患者的纤维化肾脏中，我们观察到ROCK2表达增强，且与间质纤维化呈正相关。在UUO模型中，小鼠的ROCK2蛋白水平呈时间依赖性升高。以50 mg/kg/day腹腔注射KD025治疗CKD动物，Masson三色染色显示肾脏纤维化明显减轻，纤维化基因表达减少。在体外，通过KD025或ROCK2敲低/敲除抑制ROCK2，可显著减弱转化生长因子β1(TGF-β1)引发的小鼠肾近端小管上皮细胞(mPTCs)的促纤维化反应。此外，细胞代谢受损是CKD的一个重要致病因素。通过代谢组学分析，我们发现KD025恢复了TGF-β1刺激的肾小管上皮细胞的代谢紊乱，包括谷胱甘肽代谢受损。同样，KD025增加纤维化模型中抗氧化应激酶和核因子E2相关因子2(Nrf2)的表达。此外，KD025在体外降低了纤维化肾脏中巨噬细胞的浸润和炎症反应，钝化了巨噬细胞的活化。综上所述，抑制ROCK2可能成为CKD肾小管间质纤维化的一种潜在的新疗法。
论文ID
实验设计
1.患者病理样本分析ROCK2
2.小鼠UUO模型体内验证KD025抑制ROCK2后的作用
3.KD025抑制ROCK2后的具体分子作用——炎症反应和纤维化反应
4.代谢组学分析
5.KD025抑制炎症反应和纤维化的分子机制
实验结果
1. 患者的纤维化肾脏和UUO模型中ROCK2增高
为了研究ROCK2表达水平在人纤维化肾脏中的相关性，我们选取了在病理上具有不同程度间质纤维化的16例CKD患者，然后采用免疫组化方法对ROCK2进行染色。患者肾脏的ROCK2水平与间质纤维化呈正相关，即肾小管萎缩、炎症细胞浸润及肾纤维化(图1A)。利用Nephroseq在线数据库分析成人CKD患者的PCR数据，发现CKD肾脏中ROCK2表达显著上调(图1B)，说明发生了中度至重度肾小管间质纤维化以及管状细胞损伤。这些来自儿童和成人纤维化肾脏的结果表明，ROCK2可能与肾纤维化的进展有关。近端小管中ROCK2的上调最为显著(图1A)，表明在肾纤维化过程中，ROCK2与小管上皮细胞的损伤有关。然后，我们评估了不同阻断时间(1、3、7天)的UUO模型中ROCK2的蛋白表达水平。在梗阻过程中，ROCK2蛋白水平呈时间依赖性增加。与完整肾脏相比，3天和7天的UUO模型中ROCK2蛋白的增加具有统计学意义(图1C)。同样，通过免疫组化分析，我们发现在UUO肾中ROCK2增加，并且在UUO肾近端小管中更加丰富(图1D)。
图1 患者的纤维化肾脏和UUO模型中ROCK2增高
A人纤维化肾脏中ROCK2表达的代表性图；B与对照组相比，在中度至重度肾小管间质纤维化和肾小管损伤的成年CKD患者中，ROCK2显著上调；C ROCK2蛋白水平随梗阻延长而升高；D免疫组化分析发现，ROCK2蛋白主要在UUO肾小管上皮细胞中表达上调。
2. KD025抑制ROCK2而减弱了UUO模型中肾小管间质纤维化
在人及小鼠UUO模型纤维化肾中，ROCK2显著上调，可能参与了肾小管间质纤维化。抑制ROCK2可预防肾小管间质纤维化。我们使用ROCK2抑制剂KD025，来研究阻断7天时UUO模型肾中对ROCK2的抑制作用。Masson三色染色显示对照组中梗阻肾明显纤维化(图2A)。KD025治疗后明显减轻了纤维化的程度(图2A)。免疫组化分析显示，KD025显著降低了UUO肾中的I型胶原(图2B,C)。KD025治疗后，UUO模型的肾皮质中纤连蛋白、α-sma、I型胶原、III型胶原、波形蛋白的mRNA表达也明显降低(图2D-H)。此外，KD025显著抑制了ROCK信号下游底物coffilin的磷酸化(图2I,J)，说明KD025有效抑制了ROCK信号的激活。这些数据表明，KD025抑制ROCK2能有效缓解UUO模型的肾小管间质纤维化。
图2 KD025减轻UUO模型中肾小管间质纤维化
A Masson三色染色显示UUO肾严重纤维化；B-C免疫组化分析表明，KD025可减少UUO肾脏中I型胶原的沉积；D-H RT-PCR结果显示，与对照组相比，UUO模型中纤连蛋白(D)、α-sma (E)、I型胶原(F)、III型胶原(G)和波形蛋白(H)的mRNA水平显著升高；I-J Western blotting分析显示，KD025显著降低了UUO肾中p-coffilin的蛋白水平。
3. KD025抑制ROCK2而抑制了UUO模型中炎症反应
炎症是肾小管间质纤维化的触发器，是关键的病理变化。UUO中，阻塞的肾脏出现巨噬细胞大量浸润皮质间质，如F4/80染色所示(图3A,B)。KD025治疗显著抑制了巨噬细胞的浸润(图3A,B)。这一发现得到了RT-PCR结果的支持，该结果显示KD025显著降低了促炎性细胞因子，包括TNF- TNF、IL-6和IL-1细胞因子(图3C-E)，以及促炎性介质iNOS的上调(图3F)。有报道称M2巨噬细胞标志物或富集基因的mRNA表达与肾功能不全及纤维化相关。我们发现M2巨噬细胞标志物CD206以及M2巨噬细胞富集基因Arg和YM-1在UUO肾中显著增加。在KD025治疗的小鼠肾皮质中，这种升高被抑制(图3G-I)。这些数据表明，KD025显著减少了巨噬细胞的活化，并预防了UUO肾脏中的炎症。
图3 KD025在UUO模型中具有明显的抗炎作用
A与UUO组相比，经KD025处理后F4/80阳性细胞显著减少；B免疫组化分析显示，KD025显著降低UUO模型中肾皮质F4/80染色区域；C-I在UUO模型中，很多基因mRNA表达显著升高，包括：促炎性细胞因子TNF-α(C)、IL-6 (D)和IL-1β(E)，促炎性介质iNOS (F)和CD206 (G)，M2巨噬细胞标记物以及M2巨噬细胞中富集的基因，即Arg (H)和YM-1 (I)。
4. KD025抑制或敲低/敲除ROCK2抑制了TGF-β1刺激肾小管上皮细胞的促纤维化反应
由于KD025在UUO模型中对纤维化反应具有显著的抑制作用，因此我们进一步证实KD025对肾小管上皮细胞纤维化反应的直接抑制作用。在肾小管间质纤维化中，TGF-β1诱发纤维化基因的表达，导致肾小管上皮细胞功能障碍。我们用KD025治疗TGF-β1诱导的mPTCs。免疫荧光结果显示，TGF-β1显著提高了mPTCs中纤连蛋白的水平，而KD025显著降低了纤连蛋白的水平(图4A,B)。TGF-β1诱导mPTCs中，KD025治疗可显著降低α-sma、I型胶原、III型胶原和波形蛋白的mRNA表达(图4C-F)。这些数据表明KD025抑制了TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的促纤维化反应。
接下来，我们通过基因敲低和敲除技术研究ROCK2在肾小管上皮细胞促纤维化反应中的作用。与CKD患者肾脏和UUO模型的结果一致(图1)，TGF-β1诱导的mPTCs中ROCK2蛋白水平显著升高(图4G,H)。通过使用ROCK2 siRNA，我们发现，TGF-β1处理后，敲低ROCK2可显著降低纤连蛋白的水平(图4G-I)。为了进一步证实ROCK2对TGF-β1诱导的mPTCs纤维化反应的保护作用，我们使用CRISPR/Cas 9技术敲除mPTCs中的ROCK2(图4J)。敲除ROCK2也能有效降低TGF-β1诱导的mPTCs中α-sma的mRNA表达(图4K)和纤连蛋白的蛋白表达(图4L,M)。这些数据表明，靶向ROCK2可抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化反应。
为了研究KD025的抗纤维化作用是否归因于抑制ROCK2或其他机制，我们将KD025的治疗与ROCK2的基因敲低相结合。结果证明，在TGF-β1诱导的mPTCs中，ROCK2表达上调(图5A,B)。KD025虽然对对照组mPTCs中ROCK2蛋白水平没有显著影响，但它降低了TGF-β1诱导的mPTCs中ROCK2蛋白水平(图5A,B)。KD025和敲低ROCK2基因单独或同时均可显著降低TGF-β1诱导的mPTCs中纤连蛋白水平(图5A,C)。与ROCK2 siRNA相比，KD025和ROCK2 siRNA的协同治疗并没有在TGF-β1诱导的mPTCs中起到抗纤维化的作用(图5A,C)。这些数据表明，KD025可能通过抑制ROCK2的活性而对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞产生抗纤维化作用。
Smad2的磷酸化证实了纤维化过程中TGF-β/Smads信号的激活，导致纤维化基因的转录。在UUO肾中发现Smad2的激活。如图5D-F所示，TGF-β1显著增加了mPTCs中Smad2的磷酸化。KD025和敲低ROCK2可有效降低Smad2的磷酸化水平(图5D-F)。这些数据表明，KD025和敲低ROCK2抑制了mPTCs中Smad2的磷酸化。
图4 KD025、敲低或敲除ROCK2可抑制TGF-β1诱导的mPTCs的促纤维化反应
A-B免疫荧光分析结合共聚焦显微镜显示KD025显著抑制TGF-β1诱导的纤连蛋白水平；C-F RT-PCR结果显示，KD025可显著降低TGF-β1诱导的mPTCs中α-sma (C)、collagen I (D)、collagen III (E)和vimentin (F) mRNA表达；G-I siRNA敲除ROCK2可显著降低TGF-β1诱导的mPTCs中纤连蛋白的表达；J-M ROCK2敲除的mPTCs (J)在TGF-β1诱导下，α-sma的mRNA表达明显降低(K)，纤连蛋白的蛋白表达水平明显降低(L-M)。
图5 在TGF-β1诱导的mPTCs中，KD025和敲低ROCK2可以抑制促纤维化反应和Smad2的激活
A-C敲低ROCK2和KD025显著降低TGF-β1诱导的mPTCs中ROCK2和纤连蛋白的表达；D-F敲低ROCK2和KD025抑制了TGF-β1刺激的mPTCs中Smad2的磷酸化。
5. KD025抑制ROCK2纠正了TGF-β1刺激肾小管上皮细胞的代谢重编程
肾小管上皮细胞代谢重编程参与了肾纤维化的发病机制。根据大量人类样本的全基因组转录组研究，发现代谢是纤维化肾小管中最不正常的通路之一。TGF-β1作为纤维化过程中的关键调节因子，可以诱发warburg样代谢重编程，扰乱氨基酸代谢、糖代谢和脂质代谢，引起管状上皮细胞氧化应激，参与CKD细胞损伤和成纤维过程。由于调控代谢途径也是KD025在人细胞系中的主要作用，所以我们推测KD025可能调节TGF-β1刺激的肾小管上皮细胞的代谢重编程。因此，我们采用LC-MS代谢组学方法研究有无TGF-β1诱导的mPTCs在KD025治疗下发生的代谢变化，发现77个变化的代谢物(图6A)。从数据中可以看出，经TGF-β1刺激的肾小管上皮细胞中主要是谷胱甘肽代谢发生了改变(图6B)，说明诱发了氧化应激。TGF-β1诱导谷胱甘肽水平急剧下降(图6A)，并导致谷胱甘肽合成的中间产物——γ-谷氨酰半胱氨酸积累(图6A,D)，提示谷胱甘肽的生物生成受损。值得注意的是，KD025治疗有效地恢复了谷胱甘肽代谢紊乱(图6C)，在TGF-β1刺激的肾小管上皮细胞中积累的γ-谷氨酰半胱氨酸显著减少(图6D)。这一结果表明，KD025纠正了TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞中谷胱甘肽的代谢。
除了谷胱甘肽代谢，我们还发现，戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化，淀粉和蔗糖的代谢，以及TCA循环在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞中也发生了变化(图6B)，说明TGF-β1干扰细胞的能量代谢。TGF-β1刺激的肾小管上皮细胞中嘧啶代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢也受到影响。TGF-β1也严重干扰丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸代谢；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解以及酪氨酸代谢(图6B)。KD025有效调节糖酵解或糖异生、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；果糖和甘露糖代谢；柠檬酸循环；磷酸戊糖途径；淀粉和蔗糖代谢；戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化(图6C)。从TCA循环中氧代戊二酸的水平和淀粉代谢中赤藓糖醇的水平可以看出，KD025也能修正TGF-β1刺激细胞的能量代谢(图6A)。还需注意的是，TGF-β1引发高香草酸积累，它是酪氨酸代谢途径的酸性终产物，此现象也可以被KD025逆转(图6E)。据报道，急性肾损伤患者尿液中泛酸明显减少，提示泛酸减少可能与肾小管损伤有关。我们发现，TGF-β1显著降低了mPTCs中泛酸水平，而KD025则恢复了泛酸水平(图6F)，说明KD025保护肾小管上皮细胞不受TGF-β1的影响。
这些代谢组学结果表明，KD025恢复了氨基酸代谢紊乱，特别是TGF-β1引发的谷胱甘肽代谢和能量代谢的紊乱。这些作用可能有助于TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞避免细胞损伤。
图6 KD025恢复了TGF-β1刺激肾小管上皮细胞的代谢紊乱
(A)各组小管上皮细胞代谢物相对水平的热图[(A)红色: 对照, (B)绿色: TGF-β1, (C)蓝色: KD025, (D)黄色: KD025+TGF-β1]；B-C与对照组(B)相比，KD025处理后TGF-β1诱导mPTCs的代谢通路受影响(C)；Dγ-谷氨酰半胱氨酸在TGF-β1诱导的mPTCs中水平升高，而KD025处理后明显降低；E-F KD025降低了关键代谢物的水平，包括高香草酸(E)，增加了泛酸(F)。
6. KD025抑制ROCK2可减轻氧化应激，促进Nrf2的核易位
由于KD025明显纠正了TGF-β1诱导的mPTCs中TGF-β1引发的谷胱甘肽代谢紊乱(图6A,D)，我们在动物模型中通过测量GSS的mRNA表达也进一步验证了这一发现，GSS是催化γ-谷氨酰半胱氨酸合成谷胱甘肽的酶。我们发现UUO肾中GSS的mRNA表达明显下降(图7A)，KD025显著提高了对照组和UUO肾中GSS的mRNA表达(图7A)。这一发现与我们在mPTCs中谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸的代谢组学结果相一致，表明KD025调节UUO肾脏中谷胱甘肽代谢，减轻了氧化应激。此外，我们检测了UUO肾中超氧化物歧化酶1 (SOD1)的mRNA水平，SOD1是一种抗氧化酶，在UUO肾中显著降低，而KD025治疗后显著增加(图7B)。Nrf2是调控抗氧化应激的转录因子。我们提取了mPTCs的核部分并发现KD025显著提高了细胞核中Nrf2蛋白水平(图7C,D)，表明KD025可能在一定程度上通过促进Nrf2的核转位来减轻氧化应激。
图7 KD025增加了UUO模型抗氧化应激酶的含量，增加了TGF-β1诱导的mPTCs核中Nrf2的含量
A-B UUO肾脏中GSS (A)和SOD-1 (B)均降低，而KD025处理后显著升高；C-D KD025增加了Nrf2在TGF-β1刺激的mPTCs中的核比重。
7. KD025抑制ROCK2而抑制了LPS活化的巨噬细胞的炎症反应
组织损伤后，炎症细胞(如巨噬细胞)的浸润和激活是纤维化形成的早期事件和主要驱动力。促炎性巨噬细胞或M1巨噬细胞可以介导炎症反应并促进肾纤维化。先前的研究发现，UUO早期的浸润细胞几乎全部为M1巨噬细胞。在本研究中，我们还观察到KD025减弱了UUO肾中巨噬细胞的浸润。因此，我们研究了KD025对巨噬细胞炎症反应的直接影响。我们利用LPS活化巨噬细胞(RAW264.7细胞)24小时，LPS诱导巨噬细胞发生严重炎症反应，表现出明显的细胞增殖(图8A)以及巨噬细胞中促炎性细胞因子(如IL-1β)的mRNA急剧表达和释放(图8B,C)。KD025在浓度为2.5 μM时能明显抑制LPS诱导的细胞增殖，且无细胞毒性(图8A)，表明2.5 μM KD025抑制了LPS诱导的炎症反应。2.5 μM KD025也显著降低了LPS诱导的IL-1β蛋白的释放。这些巨噬细胞的数据表明，KD025具有直接的抗炎作用，这与KD025抑制UUO肾脏的炎症反应相一致。
图8 KD025抑制LPS活化的巨噬细胞的炎症反应
A LPS处理24 h后，RAW264.7细胞的增殖能力明显提高，而2.5μM KD025明显抑制LPS诱导的细胞增殖；B-C KD025显著降低LPS诱导的IL-1β的mRNA表达(B)和释放(C)。
讨论
肾小管间质纤维化有助于CKD的病理进展，是终末期肾脏疾病的临床预测因子。然而，这种进行性的、通常不可逆的组织学改变缺乏有效的治疗干预或药物靶点。虽然Pan-ROCK抑制剂对模型小鼠具有保护作用，但对ROCK1基因敲除小鼠没有保护作用。由于ROCK2敲除小鼠大多死于出生前，因此选择性抑制剂有助于阐述ROCK2在肾间质纤维化中的意义。KD025是一种选择性ROCK2抑制剂，对00种其他3激酶或受体没有显示出脱靶效应，包括ROCK1和那些已知会受到Pan-ROCK影响的。KD025在I期临床试验中对人类是安全的，目前正在进行自身免疫性疾病和IPF的II期临床试验。在本研究中，我们发现在儿童和成人纤维化肾脏以及UUO模型小鼠中，ROCK2均显著上调。ROCK2蛋白水平与间质纤维化程度呈正相关。KD025抑制ROCK2能有效缓解UUO模型肾小鼠小管间质纤维化。由于在患者样本和UUO肾脏中，ROCK2在纤维化肾脏近端小管中迅速增加，我们研究了ROCK2对肾小管上皮细胞促纤维化反应的直接影响。敲低/敲除ROCK2和KD025阻止了TGF-β1刺激的肾小管上皮细胞的促纤维化作用，说明KD025可纠正TGF-β1诱发的肾小管上皮细胞谷胱甘肽代谢紊乱和能量代谢紊乱，可能有助于抑制TGF-β1诱导的促纤维化反应。KD025显著增加纤维化肾脏中GSS和SOD1的表达，可能是通过激活Nrf2的核易位。此外，KD025在UUO模型和LPS活化的巨噬细胞中均表现出强大的抗炎活性。这些数据表明KD025在肾小管间质纤维化中的治疗潜力，并提示ROCK2可能是治疗肾小管间质纤维化的候选药物靶点。
临床应用前景
Pan-ROCK抑制剂在CKD的肾小管间质纤维化中显示了其治疗潜力。然而，ROCK1敲除小鼠的肾纤维化没有受到ROCK1缺失的影响。由于ROCK2敲除小鼠大多在出生前死亡，因此需要研究ROCK2是否是治疗肾小管间质纤维化的合适靶点。
KD025是一种新型的ROCK2选择性抑制剂。我们发现，CKD患者和动物纤维化肾脏中，ROCK2表达上调，KD025或基因途径抑制ROCK2能有效缓解肾小管间质纤维化，纠正肾小管上皮细胞的代谢紊乱，抑制活化巨噬细胞的促炎症反应。
患者样本、动物模型和细胞培养的结果表明，处于I期临床试验的KD025可能是一种有效的治疗肾小管间质纤维化的药物。