PCR反应基本原理和反应过程

什么是PCR？

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。

PCR技术发展简史

PCR之父 Kary Mullis

PCR反应基本原理和反应过程

基本原理：

反应过程：

变性——将被复制的DNA片段在高于其Tm的条件下（94~95℃）加热，使DNA双螺旋结构的氢键断裂二解螺旋，形成两条单链分子作为扩增反应的模板，以便与引物结合。

退火——将反应体系的温度降至寡核苷酸（引物）的熔点温度以下（40~70℃），以便使引物能与模板DNA序列互补结合，形成杂交链。

延伸——将反应体系的温度升至72℃左右，此时反应体系按照模板链的序列以碱基互补配对原则以此把dNTP加至引物的3’端，在Taq DNA聚合酶的存在下，杂交链不断延伸，直至形成新的DNA双链。

PCR反应体系:

反应体系为100μL的PCR反应，其反应混合物为：

模板DNA 0.1～2μg

前后引物各20pmol；

1. 20mmol/L Tris-HCl缓冲液 (pH 8.3)；

2. 1.5mmol/L 氯化镁；

3. 0.05% Tween 20；

4. 100mg/L灭菌的明胶或无核酸酶的牛血清蛋白；

5. 1000μmol/L的四种dNTP；

6. 25mmol/L KCl；

7. 2U的Taq DNA酶。

PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成

1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3、延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。

传统的Taq估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。有修正功能的则会比较慢。