【耐药】FAT1 Loss引起对CDK4-6抑制剂耐药
陆续上市的CDK4/6抑制剂已经证明能在激素受体阳性的乳腺癌中有效，但是耐药经常性的发现而且对机制了解的很少。研究人员对348名接受过CDK4/6i治疗的ER+ BC患者做了基因组分析鉴定出FAT1和RB1的功能缺失和耐药相关联。FAT1的缺失导致CDK6显著升高，而抑制则能扭转对CDK4/6i的敏感。具体是：正常Hippo信号通路负调控的因子YAP和TAZ在CDK6启动子上聚集诱导了CDK6转录，Hippo通路中其它组分的基因变化也被发现引起CDK4/6i的耐药。因此本研究解释了Hippo通路在ER+ BC中的肿瘤抑制功能，确认了FAT1缺失作为CDK4/6i的耐药机制。
雌激素驱动激活的细胞周期因子D依赖的激酶4/6（cyclin D dependentKinase 4/6 , CDK4/6）对于ER受体阳性的乳腺癌细胞的增殖十分关键。多个临床研究已经证明了与ATP竞争结合并抑制CDK4/6的palbociclib 、ribociclib和abemaciclib治疗进展性ER+ BC中的有效性。尽管如此，有的肿瘤没有应答，大多数患者最终都会疾病进展。CDK4/6i耐药的分子机制还不清除，而且对大批将该类药物作为一线治疗的ER+ BC患者来说也有着医疗上的迫切需求。因此本研究旨在鉴定出是否有与CDK4/6i应答率差相关的基因组改变及这些改变如何修饰cyclin D-CDK4/6介导控制的细胞生长。
结果
1 FAT1缺失与CDK4/6i治疗预后差相关：在348名患者中对超过340个癌症相关的基因测序：一些常见改变如CCND1扩增、PIK3CA突变、ESR1突变与PFS不相关，而在小部分因为基因改变导致FAT1或者RB1缺失的患者中PFS显著缩短。虽然RB1缺失和耐药的关系可以通过MOA来预测【RB1是抑癌基因】，但FAT1却不能。
2 FAT1缺失促进了CDK4/6i的耐药：FAT1先前发现存在一个HNC进展相关的LOF突变，所以和癌细胞生长相关联。MSKCC分析了1501份ER+/HER2- BC的测序结果，原发性肿瘤和转移型肿瘤中FAT1突变分别2%和6%，但是并没有鉴定出频发突变和热点突变，相反有害突变（截短、移框、剪接位点或者纯合子缺失）占了1/3，FAT1突变的肿瘤中最常见的基因改变与PI3K3CA、TP53这些相似。携带有害突变的患者PFS 2.4mo，远低于野生型的10.1 mo，结果和RB1缺失的一样，说明这两个基因的缺失与预后差相关。另外对每个样本的TMB及先前治疗轮数进行校正，结果也是很显著。
其中1名转移型ER+ BC患者接受palbociclib和氟维司群治疗在首次影响学检查获得缓解，肝脏病灶迅速转移（PFS 2.5mo），但肺部和胸部淋巴结肿瘤依旧有应答，对肝转移的治后活检发现4号染色体上发现了有害的结构重排产生了ADAM19和FAT1的融合，导致了FAT1上最主要的外显子和内含子区域丢失，导致了FAT1功能完全。这名患者在治疗前肺部病灶（对CDK4/6i应答）也有活检，比较两份结果，ADAM29-FAT1融合是治疗后肝脏样本中唯一的变化，而并不存在于治疗前的样本中，进一步将FAT1功能缺失与耐药相关联。这些基因组数据将RB1和FAT1抑癌基因中的LOF突变与耐药紧密的联系在一起。
3 FAT1缺失直接引起CDK4/6i耐药：为了确认FAT1缺失是否以及如何介导对CDK4/6i的耐药，从ER+并对CDK4/6i敏感的MCF7构建了多个FAT1敲除或者FAT1 敲低的细胞株，可以看出：在没有药物的情况下，FAT1蛋白表达的缺失并不影响肿瘤细胞的增长；而暴露在50nM ademaciclib中时，MCF7的生长完全被抑制，而FAT1敲除或者FAT1敲低的细胞株并没受影响。
为了确认耐药是不是通过CDK4/6的敏感型降低来实现，检测了在药物中暴露了24hrs以后CDK4/6底物的磷酸化水平：MCF7细胞中Rb的磷酸化完全被阻断了（S780/S807/S811），而在FAT1缺失的细胞中只是部分被抑制。后来发现FAT1缺失并未完全消除药效，而是将生长抑制常数提升了4-6倍并增强了CDK6的过表达（补充材料图S3，文中未显示）。
为了排除这些结果并不受限于特定的模型和CDK4/6i的选择。后面首先在对CDK4/6i敏感的ER+ CAMA-1细胞株中也看到了FAT1缺失能减弱对abemaciclib的应答，随后用palbociclib和ribociclib测试，也发现FAT1缺失的细胞也需要更高剂量的药物来抑制Rb磷酸化和阻断增殖。
4 FAT1缺失引起CDK6的表达：因为FAT1缺失改变了CDK4/6i阻断Rb磷酸化的浓度，因此假设cyclin D-CDK4/6复合物中的组分可能受到了FAT1调控。进一步检测了这些部分的mRNA和蛋白质水平，发现所有的FAT1被抑制的模型中CDK6都有显著的提升，CDK6的诱导不仅仅在MCF7来源的细胞中被发现，在CAMA-1模型中也发现看FAT1的上调。
TCGA的结果也显示ER+ BC的FAT1敲除的样本中CDK6转录产物也显著高于FAT1野生型的样本（图4D）。另外发现改造前的敏感细胞株基线的CDK6表达显著低于CDK4，TCGA的结果也显示除了FAT1阴性外，大多数ER+ BC细胞中CDK4的表达都是显著高于CDK6（图4E）。相反其他组分，如cyclin D1和pRB等在各个模型之间并不一致。总之，这些数据提示，FAT1野生型的ER+ BC中CDK6的表达通常被压制，CDK4是主要是G1-S1的激酶。另外在来源于MCF7的耐药型细胞株MR3和MR O9中发现FAT1水平显著抑制。这些细胞株，包括MR3、MR O9及上述FAT1敲除和FAT1敲低的细胞株，FAT1的抑制与CDK6表达的高水平与亲本MCF7比较，相关性更显著（图4F）。而早先的研究已经发现高水平的CDK6能促进对抗雌激素及CDK4/6i治疗的耐药。
为了确认FAT1缺失对CDK6表达水平的影响是否足以促进对CDK4/6i的耐药，设计了靶向CDK6 mRNA 3’UTR的shRNA使得CDK6蛋白下调到亲本水平，扭转了野生型CDK6 cDNA的过表达。研究发现这样敲低CDK6能够恢复ademaciclib（100 nM）完全抑制细胞增殖和Rb磷酸化（绿色），在此基础上过表达CDK6亦可增强对药物的不敏感性（粉色，图4G）。
最后想看下FAT1低表达肿瘤中是否有CDK6表达上调的证据，因此构建了ER+ BC患者来源的PDX：最初对CDK4/6i治疗敏感后来异质性的进化耐药（图4H），IHC检测了FAT1和CDK6的水平。ribociclib处理9周后，耐药肿瘤的胞质和膜上FAT1低表达，而敏感的肿瘤有着FAT1表达较强。因此低FAT1的PDX有着高表达的CDK6，反之高FAT1则没有。免疫印迹（补充材料，未显示）结果和IHC一致，相比依旧敏感的PDX，发展成耐药的PDX有着FAT1的降低和CDK6的诱导表达。另外FAT1阴性的肿瘤样本的IHC也显示低FAT1和强的CDK6表达，相比之下野生型FAT1的患者肿瘤中FAT1高而CDK6相对低。另外相比FAT1野生型患者，突变患者肿瘤的IHC量化平均打分结果中也是显著更低的FAT1、更高的CDK6。这些数据能够证明CDK6表达水平上调与FAT1缺失或抑制高度一致。
5 FAT1通过Hippo通路调控CDK6的表达：先前研究指出头颈部癌中β-catenin或者Hippo可能是FAT1下游的效应通路，另外非癌细胞中的研究中FAT1是Hippo通路非常规的激活因子。为了确认FAT1调控CDK6是否通过了上述通路，qPCR在亲本和FAT1缺失的细胞株中检测了信号网络中多个靶基因，Wnt/β-carenin靶点AXIN2和MYC的表达不受FAT1缺失的影响，而CTGF和CYR61显著上调，与Hippo通路下调一致（图5A）。为了确认Wnt/β-carenin通路对FAT1缺失的结果是否必需和充分，在FAT1缺失和耐药的细胞株中敲低了β-carenin，发现对abemaciclib的敏感和CDK6表达水平没有明显的影响（补充材料图S5A，未显示）。进一步验证抑制Wnt通路效应因子YAP和TAZ是否影响FAT1缺失的细胞株中的CDK6，结果显示单独敲低YAP或者同时敲低TAZ都可以抑制关键靶点如CTGF和CDK6的表达（图5B及补充材料S5B，未显示），恢复FAT1缺失的细胞株对CDK4/6i的敏感（图5C）。
这些结果提示YAP/TAZ是诱导CDK6表达的关键，研究人员想进一步找出这些转录因子如何影响乳腺癌中CDK6的分子机制。先前研究在CDK6启动子上鉴定出两个关键的TEAD结合位点，研究人员用Ch-IP/qPCR方法发现：图5D中，相比亲本细胞株。FAT1缺失的细胞株在这两个位点有YAP/TAZ的大量富集，而转入显性失活的TEAD载体则破坏了CDK6的诱导表达。为了验证FAT1是否足以抑制CDK6和Hippo通路其它靶基因的表达，研究人员在FAT1敲除的细胞株中构建并表达了FAT1的胞内结构域（CD4-FAT1-ICD），表达的FAT1部分可以在一定程度上通过Hippo通路中多个靶点（AREG、CYR61和BRIC5）抑制CDK6的转录，进一步证实了FAT1在通过Hippo通路相关组分来调控CDK6表达中的角色。
为了进一步确认FAT1和YAP激活的关系，免疫荧光检测了YAP的定位：相比亲本MCF7细胞株，FAT1敲低的细胞中YAP有着很强的核定位信号（图5E），同样在低FAT1的PDX模型及人乳腺癌肿瘤中也发现了升高的YAP核定位。最后检测了Hippo通路中YAP上游的组分，在FAT1敲除的细胞及低FAT1的PDX中发现了Hippo通路被抑制：MST1和LAST1的磷酸化缺失（图5F），这个和之前观察到的FAT1缺失引起Hippo通路抑制和YAP/TAZ激活相一致。在转录组水平上，研究人员通过RNA测序比较了FAT1敲除的细胞株和野生型，发现敲除的细胞中CDK6和CTGF的mRNA上调，可见在FAT1阴性模型中发现了Hippo通路调控的基因的富集，具有统计学上的显著意义。
6 Hippo通路变化与耐药：研究人员假设在FAT1缺失之外，包括Hippo通路的组成型抑制的其它机制可能也会乳腺癌细胞对CDK4/6i的耐药。就像NF2编码的Merlin就是一个已知的定位到细胞膜上的调控Hippo通路的肿瘤抑制因子，免疫荧光结果显示NF2和FAT1共定位到细胞质膜（图6A）。为了确认是否NF2缺失也会引起类似FAT1缺失的效果，研究人员在MCF7细胞株中用crispr构建2个敲除NF2的模型，免疫印迹显示NF2表达被抑制（~85%，图6B）。和FAT1缺失一样，在abemaciclib处理后敲除NF2的细胞中CDK6的表达也是明显高于亲本细胞（图6B、C），NF2缺失和高CDK6也证明与abemaceclib对细胞生长抑制的不足相关（图6D）。基于这些，Hippo通路中其它致癌性改变也与临床上的耐药关联。
尽管Hippo通路中基因组改变的个体很少，但是全部与ER+ BC患者对CDK4/6i的缓解率下降相关（HR 3.61, P=0.00044）。这些结果也证明完整的Hippo通路和低水平CDK6是CDK4/6i在众多ER+mBC患者中广泛有效的另一个基础。