分泌BiTE的CAR-T规避抗原逃逸
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正 文
研究背景
胶质母细胞瘤(GBM)是常见的恶性脑部肿瘤，目前治疗包括手术、放疗和替莫唑胺化疗，颅内获益有限，同时也会引起对正常脑组织的毒性和损伤。近来开展多个CAR-T治疗GBM的临床研究，其中有报道可以抑制晚期的多灶性胶质母细胞瘤，但是这些缓解并不一致，很大程度上是因为肿瘤抗原表达的异质性以及单靶点CAR-T治疗后引起的逃逸。
该团队先前开发了靶向表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)的CAR-T的研究，EGFRvIII只在肿瘤组织中表达但是在正常组织中缺失。在一项FIH研究中，单剂量注射EGFRvIII CAR-T引起患者体内EGFRvIII+ GBM消退，随后的手术切除显示CAR-T细胞很好的浸润进了脑部肿瘤，但是存活的肿瘤普遍存在并且有着野生型EGFR的高表达。为了解决抗原异质性并增强局部的抗肿瘤活性，研究人员进一步对EGFRvIII CAR-T进行基因改造，分泌类似BiTEs的双抗来靶向在正常脑组织中不表达但在80%GBM中扩增的野生型EGFR。
这里展示了CAR-T分泌靶向EGFR的BiTEs介导了强效和特异的杀伤异质性肿瘤活性，已经减轻了EGFRvIII抗原丢失的影响。同时局部的BiTE分泌能够使得靶向EGFR这种对于BiTEs和CAR-T来说因为在靶毒性风险不可成药的抗原成为可能。
研究结果
1、CART.BiTE对EGFRvIII异质性表达的肿瘤有效
30%的GBM表达EGFRvIII，而≥80%表达野生型EGFR，一旦GBM中缺失了EGFRvIIII突变体，主要就是保持着野生型EGFR的扩增。尽管EGFR在包括肺、皮肤和肠道等多个正常组织，但是分析了多个健康人的样本组织后并没有检测到EGFR在CNS的表达。
首先为了重现在复发模型中的抗原逃逸，种植了EGFRvIII异质性表达肿瘤的小鼠在接受EGFRvIII CAR-T输注后肿瘤生长得到遏制，但是很快进展，IHC分析和之前的结果一致：EGFRvIII缺失但是保持着EGFR表达；因此研究人员开发了CART.BiTE，理论上可靶向多个靶点并招募和激活周边的T细胞这类最主要的浸润细胞：相比于传统CAR-T只能靶向EGFR vIII+的肿瘤，CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR除了靶向EGFRvIII+肿瘤外，分泌的BiTE还能靶向EGFR+肿瘤的同时将周边未转T细胞拉到肿瘤细胞附近。
在小鼠模型的探索性实验中，CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR相比CART-EGFRvIII.BiTE-CD19能引起明显持久的缓解（黄 vs 紫色）。另外脑内注射CART.BiTE时，偶尔会在外周发现CAR-T，但是非常少见，尤其在处理EGFRvIII+ 肿瘤时还会降低，全身安全性可控。
2、设计和制备CART.BiTE
基于二代EGFRvIII CAR骨架，设计了CART.BiTE，包含靶向EGFRvIII的生存Fv，同时表达的BiTE分别靶向EGFR和CD19(作为阴性对照)；基于相同骨架构建了不分泌BiTE的CAR，分别靶向EGFRvIII、EGFR和CD19。所有的载体后面加有mCherry荧光报告基因来评估转染效率。
BiTE在设计上一边靶向抗原EGFR或CD19，另一边结合CD3激活T细胞，由于5'端加上了Igκ 分泌信号肽，转染HEK细胞后在上清也能检测到对应的BiTE表达，说明CART.BiTE转染细胞后可以分泌BiTE。
T细胞转染后分泌的BiTE能特异性识别表达了对应抗原的K562细胞，同样BiTE也能通过anti-CD3 scFv识别CD3来结合T细胞；只有在转染了CART.BiTE的细胞的上清中能够检测到BiTE且整体BiTE的浓度随着时间升高，说明T细胞在扩增。
3、分泌的BiTE可以招募周边T细胞起效
事实上还不清楚分泌的BiTE只是重定向转染的CAR-T，还是会招募周边未转染的T细胞。为了定性BiTEs和周边T细胞，研究人员用共聚焦显微镜分析了EGFR-BiTE和CAR-T细胞及未转染T细胞的分布，用mCherry FP的表达来鉴定转染的细胞，用生物素标记的EGFR去检测anti-EGFR scFv——包括CAR形式和BiTEs形式，另外用CART-EGFR细胞作为阳性对照，可以看出：CART EGFR成功的结合了游离的EGFR抗原(红绿信号完全merge)，分泌的BiTE-CD19完全不结合任何形式的EGFR，而BiTE EGFR不仅仅结合转染的mCherry+ 细胞，同样也成簇的结合周边的mCherry-的未转染细胞。
随后研究者评估了BiTEs招募周边T细胞后可能的利用旁分泌免疫效应杀伤肿瘤细胞的能力，发现只有CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR才能在早期诱导mCherry阴性的细胞中CD25和CD69，而CART-EGFR只用和mCherry阳性的细胞孵育时才观察到这种激活。而CAR-T及CART.BiTEs与Jurkat T及EGFR+ 肿瘤细胞共孵育后，只有存在EGFR-BiTEs时才会激活抗原特异的T细胞激活。
随后通过检测周边T细胞的增殖、细胞因子释放和抗肿瘤的细胞毒作用来评估EGFR.BiTE诱导周边T细胞功能活性的程度。CART-EGFR一旦遇到靶抗原可以无选择性的增殖，而CART-EGFRvIII及CART-EGFRvIII.BiTE-CD19组没有观察到；相反，在和CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR孵育后，周边T细胞也迅速增殖。
最后研究人员用Transwell系统来构建了隔绝了基因修饰细胞及未转染细胞，只允许游离的BiTEs自由穿越，发现一侧CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR分泌的BiTE成功的穿越屏障，介导了另一侧未转染效应细胞Th1类细胞因子的分泌和对GBM抗原特异的细胞毒作用。这个结果在CART-EGFRvIII.BiTE-CD19和表达CD19的靶细胞孵育时也存在。
4、CAR和BiTE同时重定向引起T细胞分化
研究人员分离了纯度97.5%以上的转染成功的mCherry阳性CAR-T亚群(排除了CAR阴性的周边T细胞影响)，发现成功转入CAR的T细胞保有通过BiTE介导的细胞毒作用来裂解肿瘤细胞的活性(U87为EGFR高表达的肿瘤细胞株，U87CD19则是U87基础上表达CD19，发现只有CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR才能对U87发挥细胞毒作用；只有CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR和CART-EGFRvIII.BiTE-CD19才能对U87CD19发挥细胞毒作用；这说明CART.BiTE分泌的BiTE足以介导细胞毒效应)；另外，像CART-EGFRvIII、CART-EGFRvIII.BiTE-CD19和CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR对U87vIII(同时表达EGFR和EGFRvIII)都观察到细胞毒效应，说明通过BiTE重定向可以产生和单独CAR类似的细胞毒效应，这些结果表明CAR和BiTE不会相互排斥。另外从时间上看，单独BiTE的激活在12 d后达到平台期，而CAR介导的激活可以持续30 d以上。
临床上发现，BiTE选择性的促进分化较好的效应记忆性T细胞(TEM)的扩增，而用分化程度较低的干细胞样记忆性T细胞(TSCM)或中枢记忆性T细胞(TCM)制备的CAR-T有着更好的疗效。上述抗原刺激的差异可能就是有这些独特的T细胞亚群相关，在激活3小时后分析T细胞亚群发现，单独BiTE引起了TEM的富集，而CAR-T及CART.BiTE则偏向引起分化程度较低的TCM亚群的提升。
最后分析T细胞耗竭相关的标志物：单独BiTE激活最终上调了多个与T细胞耗竭相关的免疫检查点抑制剂(PD-1、Lag-3和Tim-3)，但是CAR+BiTE联合则通过共刺激信号减轻了这种耗竭。
5、CART.BiTE在多个胶母细胞瘤模型及PDX中有效
接下来检测CART.BiTE对表达EGFR或EGFRvIII的胶母细胞瘤模型的活性，首先将构建好的载体转入Jurkat T细胞，评估是否可以激活EGFRvIII- EGFR+的胶母细胞瘤的细胞株，只有CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR组才观察到和CART-EGFR一样选择性的激活。
而在相似的实验中，将载体转入人原代T细胞后与GBM细胞孵育，发现CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR激活后以BiTE依赖、EGFR特异的形式分泌促炎因子IFN-γ和TNF-α。
在不同的E/T比值范围内，CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR和多个GBM细胞株孵育后可以快速引起靶细胞活性降低，同时相比单独的CART-EGFR体现出更加特异和强效的细胞毒效应。
下面看下在GBM PDX中的活性，首先制备了BT74，可以异质性表达EGFRvIII和扩增的EGFR，在BT74时CART-EGFRvIII.BiTE-CD19也观察到激活，但强度相比CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR低，和CAR识别EGFRvIIII后引起的激活强度相近；而对BT74，只有CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR才有抗肿瘤活性，也就是说对于共表达EGFRvIII和EGFR的GBM，抗肿瘤活性除了CAR外还依赖于BiTE-EGFR。
6、CART.BiTE在小鼠中处理EGFRvIII阴性GBM时安全有效
接下来确认CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR在体内的活性是否依赖于识别EGFRvIII，或是分泌的BiTEs是否足引起抗肿瘤效应。研究人员将人胶质瘤细胞(U251)原位移植到NSG小鼠，随后注射CART.BiTE细胞，观察到CART-EGFRvIII.BiTE-EGFR引起小鼠中GBM负荷的降低，
因为BiTE-EGFR即便在EGFRvIII足以引起对GBM的抗肿瘤活性，但是仍有疑问就是CART.BiTE是否会引起人正常组织中on-target off-tumor毒性。这里假设只要给一个低水平的BiTE分泌，局部靶向EGFR就会提高安全谱。为了验证这个假说，研究人员采用了先前发表的一个皮肤移植毒性模型，可以体内评估对表达EGFR的人正常组织的免疫反应，主要也是因为皮肤毒性是靶向EGFR的药物的主要不良反应。
研究人员将人皮肤移植到NSG小鼠背部，并用IHC确认了EGFR表达，CART-EGFR作为阳性对照，而EGFRvIII.BiTE-CD19作为阴性对照，发现CART-EGFR处理小鼠的皮肤移植物的真皮和表皮上发现淋巴细胞的深度浸润，IHC分析显示CD3+ T细胞的快速浸润，伴随着周边角质形成细胞的凋亡(TUNEL)，和皮肤性GVHD一致。这些现象在EGFRvIII.BiTE-EGFR处理的小鼠中没有发现，进一步的定量发现和阴性组没有差异(黄 vs 紫)。
CART.BiTE处理的小鼠样本在外周血中并未检测到BiTE，考虑到角质细胞中EGFR表达低于GBM，提示如果全身给药很可能会分泌少量BiTE靶向表达EGFR的正常组织。
小结
CAR-T治疗实体瘤通常受限于靶抗原表达的异质性、缺少可供靶向的抗原。这里研究人员开发了一个双顺反子载体，能够表达靶向胶质母细胞瘤中特异性的 EGFRvIII的CAR和靶向在胶质母细胞瘤和正常细胞中都高表达的EGFR的BiTEs。这个新型的CART.BiTE细胞分泌的EGFR特异的BiTEs可以将CAR-T重定向并招募周边未转染的T细胞靶向野生型EGFR。EGFRvIII CAR-T单独无法完全清除EGFRvIII异质性表达的肿瘤，同时会引起EGFRvIII- EGFR+的GBM的发展。但是CART.BiTE细胞可以清除小鼠胶质母细胞瘤模型中的异质性肿瘤，BiTE局部有效且无全身毒性；另外不像EGFR CAR-T，CART.BiTE细胞不会在体内引起对皮肤移植物的毒性。