科研 | Cell子刊：宿主代谢紊乱时产生乳酸并促进沙门菌的生长
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在肠道沙门菌感染期间，肠道黏膜炎症会创造出一种可以利于沙门菌增殖并使其成为优势菌群的生境。在此，我们发现在沙门菌感染的同时还会出现机体代谢的紊乱：肠道内丁酸水平下降，而乳酸水平升高。在小鼠动物实验中通过使用乳酸脱氢酶抑制剂后可以抑制肠内乳酸的生成，提示乳酸的来源可能是宿主。无论是通过口服抗生素或是通过感染病原菌所导致的肠内产丁酸的梭状芽孢杆菌的减少，都会触发宿主从氧化代谢转变为乳酸发酵，增加了乳酸的同时也增加了沙门菌对乳酸的利用。通过服用三丁酸甘油酯或PPARr受体激动剂不仅可以减少机体产生乳酸，同时也抑制了沙门菌对乳酸的优势利用。因此，我们的结论是肠道微环境的改变，尤其是梭状芽孢杆菌的消耗，可以重调宿主代谢，使宿主由原来的氧化代谢转变为乳酸发酵，并进一步促进了沙门菌的感染。
论文ID
原名：Dysbiosis-Associated Change in Host MetabolismGenerates Lactate to Support Salmonella Growth
译名：宿主代谢紊乱时产生的乳酸可以促进沙门菌的生长
期刊：Cell Host & Microbe
IF：17.872
发表时间：2018年
通信作者：Sebastian E. Winter
通信作者单位：德克萨斯大学西南医学中心
实验设计
实验设计流程图
实验内容
1 在沙门菌感染时肠道内乳酸水平是升高的
为了更好地了解在沙门菌感染期间肠道内代谢发生了哪些变化，我们对肠道腔内的胞外代谢物进行了半定量分析。具体操作如下：两组Swiss Webster小鼠通过灌胃的方式分别接种野生型沙门菌菌株（实验组）或液体LB（对照组），感染7天后，收集两组小鼠盲肠内容物，并通过气相色谱串联质谱(GC/MS)仪对收集的小鼠盲肠内容物进行代谢分析，结果发现两组间确实存在几种表达差异的代谢物（Table S1），其中变化最明显的是乳酸。即沙门菌感染后，乳酸在肠道内出现了明显的富集。为了进一步证实我们的发现，我们开发了一种通过方法通过GC/MS/MS分析仪对肠道内容物乳酸进行定量的检测技术。与之前的现象一致，我们再次发现沙门菌感染后盲肠内乳酸水平明显增加（Figure 1A），由此我们推测在沙门菌感染时，乳酸可能会成为沙门菌的一种营养来源。
2 在肠道炎症时乳酸为沙门菌提供了适应性生长优势
研究表明沙门菌染色体上存在可以编码两种乳酸脱氢酶（LIdD和DId）的基因。为了研究沙门菌中这两个酶的活性，我们进行了体外竞争实验(Figure S1)。结果发现，在无乳酸的培养基中无论是野生型的沙门菌株AJB715还是构建的ΔlldDΔdld的突变株都呈现出相似的生长情况，说明在乳酸脱氢酶（LIdD和DId）缺失的突变菌株中并没有出现厌氧生长的缺陷 。但是向培养基中加入乳酸及外源性电子受体时，野生型的沙门菌生长立即超过ΔlldDΔdld突变株。接下来我们想要观察在小鼠体内感染模型中乳酸脱氢酶是否可以为沙门菌提供适应性生长优势？将Swiss Webster小鼠通过灌胃方式感染沙门菌野生型和ΔlldDΔdld突变株的混合物，感染8天后，分别对小鼠盲肠组织、结肠组织及肠腔中的菌群进行分析。结果显示，感染8天后，小鼠盲肠黏膜已经出现了实质性的病理改变(Figures S2A–S2D)，而结肠病理改变却不大。此外，在盲肠中野生型的沙门菌数量明显多于ΔlldDΔdld突变株（13倍，P<0.05）（Fig 1B）。那么，是否乳酸氧化可以为肠道中的菌群提供一个适应性的优势呢？我们同样将两组Swiss Webster小鼠分别灌胃感染沙门菌野生型或ΔlldDΔdld突变株，感染8天后，盲肠和结肠中的ΔlldDΔdld突变株与野生株相比明显减少（Fig 1C）。综上所述，肠道沙门菌感染后，乳酸水平不仅会增加并且乳酸还可以为病原沙门菌提供适应性生长优势。
3 沙门菌利用的乳酸主要来源是宿主
接下来，我们想要寻找肠内乳酸的来源。首先我们考虑到乳酸是否来自小鼠的日常饮食中，我们重复了野生型沙门菌与ΔlldD Δdld突变株的竞争实验，并将其中小鼠的饲料换成了无乳酸的饲料（Fig 1B）。在这次实验中，野生型沙门菌与ΔlldD Δdld突变株相比，发现野生型沙门菌仍然具有生长优势，说明饮食中的乳酸并非起主要作用。文献报道过沙门菌染色体上还可以编码第三种乳酸脱氢酶（IdhA），并参与乳酸发酵。既然如此，是否乳酸也可能来自沙门菌？为了验证这种可能性，我们把 ΔldhA 突变株与 ΔldhA ΔlldD Δdld 突变株进行体外竞争性实验，发现即使IdhA酶缺失，乳酸脱氢酶仍然可以提供一个适应性生长优势（Fig 1B），说明乳酸的主要来源也并不是沙门菌。鉴于肠道中有很多的微生物都可以产生乳酸，因此我们假设乳酸是否来自于其他的肠道微生物。为此我们这次使用无菌鼠作为感染对象，但是普通的无菌鼠由于一直饲养在无菌环境中，实验暴露于沙门菌发生感染后却发生无法控制的继发全身感染并最终导致死亡。因此，为了避免上述现象，我们构建了缺失TSS-2功能的沙门菌突变株（ΔsseD）。无菌鼠通过灌胃的方式感染沙门菌ΔsseD突变株及ΔsseD ΔlldD Δdld突变株，10天后可以明显观察到盲肠炎症反应，重要的是，ΔsseD突变株与ΔsseD ΔlldD Δdld突变株相比具有明显的生长优势（Fig 1D），说明即使在沙门菌单一菌感染时，乳酸仍然可以为其提供生长优势，那么乳酸来源可能并不是其他的肠道菌群。接下来我们想知道宿主是否可能是乳酸的来源？我们把Swiss Webster小鼠通过灌胃的方式，服用草氨酸钠（一种乳酸脱氢酶抑制剂）2天后，对其盲肠中的乳酸进行GC/MS/MS检测（Fig 1E），发现乳酸的生成被明显的抑制了，说明乳酸的来源很大可能是宿主。体外实验表明沙门菌既可以利用L型乳酸也可以利用D型乳酸。哺乳动物只产生L型乳酸，而微生物却可以同时产生这两种乳酸。基于此理论，我们推测在沙门菌感染时，沙门菌所利用的乳酸大部分是L型乳酸。单突变ΔlldD 与双突变ΔlldD Δdld的实验结果没有明显的差异即可支持以上假设（Fig 1B）。当我们把lldD基因回补后，发现这种适应性生长优势又出现了（Fig 1B），综合以上数据表明宿主来源的乳酸可以在沙门菌感染时，为其提供适应性生长优势。
Fig1.沙门菌感染时升高的乳酸大部分来源于宿主
4 产丁酸的微生物的消耗可以使得肠道上皮细胞代谢转化为乳酸发酵
在正常情况下，肠道上皮细胞中，丁酸通过β-氧化和氧化磷酸化产生能量的。在丁酸缺失时，例如，无菌鼠肠道上皮细胞会重新调节自身代谢由脂肪酸氧化转变为葡萄糖发酵并最终生成乳酸。文献报道在感染性和非感染性动物结肠炎模型中，梭状芽孢杆菌属的耗尽会伴随丁酸的减少及结肠细胞的代谢的改变。因此，我们推测在无病原菌感染时，是否仅通过使用抗生素造成的梭状芽孢杆菌的耗尽就会使得肠道中的乳酸增加？为了验证这一点，我们给与C57BL/6小鼠口服链霉素(Figure 2)。经过链霉素处理后，小鼠肠内梭状芽孢杆菌数量至少减少了4个数量级，3-4天后，菌群数量可以恢复至正常(Figure 2A)。伴随着梭状芽孢杆菌减少的同时，盲肠中的丁酸浓度也在减少(Figure 2B)。相反，乳酸水平有明显的增加(Figure 2C)。为了观察是否添加外源性的丁酸补充剂可以抑制乳酸升高的水平，我们给链霉素处理后的小鼠口服三丁酸甘油酯(Figure 2D)。这种外源性丁酸补充剂可以明显抑制链霉素处理后盲肠内乳酸的生成。以上实验表明，微生物中丁酸的减少可以使宿主代谢转变为乳酸发酵。
Fig2. 口服链霉素扰乱肠道微生物可导致乳酸升高
5 沙门菌可以利用抗生素诱导产生的乳酸来增殖
C57BL/6小鼠通过灌胃方式给与一定剂量的链霉素，一天后，再把这些小鼠通过灌胃的方式接种沙门菌。感染五天后，采集盲肠内容物进行16S qRCP分析并同时检测肠内乳酸和丁酸的浓度(Figures 3 and S5E)。与正常对照组小鼠相比，经过链霉素处理及沙门菌感染后的小鼠肠内梭状芽孢杆菌和拟杆菌门的数量显著减少，肠杆菌科的数量显著增加(Figure 3A)，同时实验组中小鼠与对照组相比盲肠中丁酸水平显著下降，乳酸水平显著升高(Figures 3B and 3C)。乳酸脱氢酶（5.4倍），尤其是L-型乳酸脱氢酶LIdD（5.1倍），为野生型沙门菌在小鼠盲肠中定植提供了优势，因为在竞争实验中野生型沙门菌数量上要明显高于 ΔlldD Δdld 和ΔlldD 突变株 (Figure 3D)。同样，乳酸也可以为缺失T3SS-1 和T3SS-2的沙门菌提供生长优势(Figures 3D, 3E, and S5A–S5C)。接下来我们想知道，在沙门菌感染时，是否抑制宿主的乳酸脱氢酶就可以降低乳酸为沙门菌提供的生长优势？我们把经过链霉素处理后的小鼠灌胃感染沙门野生型和 ΔlldD Δdld 突变株，并且在小鼠饮用水添加草酸钠抑制剂。感染4天后，计算竞争指数。服用草酸钠后可以消除乳酸给予沙门菌的生长优势 (Figure 3F)。草酸钠并不能直接抑制LldD和Dld活性(Figure S1C)。综上所述，以上实验进一步证实了在沙门菌感染时，升高的乳酸是由宿主代谢产生的。
Fig3.沙门菌可利用抗生素诱导下升高的乳酸
6 沙门菌导致的代谢紊乱是以产丁酸的索状芽孢杆菌耗尽为特征的
为了观察沙门菌感染后肠道内微生物的改变，我们把Swiss Webster小鼠灌胃接种野生型沙门菌。八天后，采集小鼠盲肠内容物进行16S rDNA测序分析 (Figures 4A–4C)。主成分分析图显示，实验组小鼠与对照小组肠道内的微生物存在明显的聚类差异 (Figure 4A)。在沙门菌感染后，肠道内拟杆菌门和后壁菌门有明显的下降(Figure 4B)。尤其是梭状芽孢杆菌减少的最为明显（3倍，p<0.05），相反，γ-变形菌门，出现明显的升高(Figure 4C)。与我们初步分析一致，通过GC/MS检测丁酸证实，对照组小鼠肠道内丁酸要比沙门菌感染小鼠（实验组）高出10倍左右(Figure 4D)，同时乳酸浓度也有所增加(Figure 1A)。乳酸提供的适应性优势与盲肠炎症程度及时间具有相关性(FigureS6)。在化学诱导（葡聚糖硫酸钠）的结肠炎模型中，乳酸也可以为缺少毒力因子的沙门菌提供适应性优势，与在肠道炎症时足以产生足够的乳酸观点一致(Figure 3D)。综上所述，这些数据说明沙门菌引起的炎症与产丁酸的梭状芽孢杆菌的耗尽有关，而梭状芽孢杆菌的耗尽又与乳酸的升高相关。
Fig4. 沙门菌感染时肠道微生物的改变
7 PPARγ信号通路影响沙门菌感染时乳酸的生成
PPARγ是一种转录因子，参与宿主脂肪酸代谢的调控，将葡萄糖发酵转为β-氧化。因此我们推测肠道上皮细胞产生的乳酸可以激活PPARγ信号通路。我们使用PPARγ受体激动剂罗格列酮通过腹腔注射的方法给予链霉素处理后的C57BL/6小鼠，促使小鼠上皮细胞β-氧化 (Figures 5B and 5C)。与我们预期结果一致，与对照组相比罗格列酮并没有影响到链霉素介导的肠道丁酸的耗尽 (Figure 5B)。有趣的是，在注射罗格列酮后，链霉素处理过的合并沙门菌感染的小鼠体内，由L-型乳酸利用的适应性优势也下降了(Figure 5D)。以上实验说明在沙门菌感染时PPARγ参与调控宿主上皮细胞中乳酸的产生。
Fig5. PPARγ信号通过可调节沙门菌感染时乳酸的生成
8 氧是乳酸利用的终末电子受体
接下来我们想知道乳酸利用的终末电子是什么？在机体稳态时，β-氧化可以消耗大量的氧气。在沙门菌感染时，未被消耗的氧气就可以进入肠腔，使得肠道中的兼性厌氧病原体进行呼吸。此外还有硝酸盐和四硫磺酸盐也是炎症氧化的副产物。在体外实验中，乳酸的利用是发生在微需氧的条件下（1%氧气） (Figures S1A and 6A)。在体外的厌氧条件下，乳酸脱氢酶仅在硝酸盐和四硫磺酸盐存在时才提供一个生长优势 (Figure S1A)，为了检测在乳酸利用时是否需要硝酸盐和四硫磺酸盐，我们构建了一个缺失moaA基因的突变株，moaA基因参与催化钼喋呤生物合成的第一步，也是四硫磺酸和硝酸盐还原酶中一个必要的辅因子。我们在链霉素处理过的C57BL/6小鼠体内进行了竞争实验(Figure S5D)。在钼喋呤缺失时，乳酸脱氢酶所赋予的适应性优势可能仍然存在。即在缺失moaA基因的突变株中，钼-辅因子依赖的厌氧呼吸通路对于乳酸的利用是非必要的。为了验证我们之前推测的氧可能是乳酸利用的终末电子受体这一观点，我们构建了缺失CydAB活性的突变菌。CydAB是微需氧条件下表达的一种终末氧化酶。在链霉素处理后的小鼠模型中，我们进行了ΔcydA突变株和ΔcydA ΔlldD双突变株的竞争实验。结果发现在缺失CydAB活性时(Figures 6A and 6B)，乳酸脱氢酶提供的适应性优势(Figures 3D and 6B)也不存在了，说明氧是沙门菌感染时乳酸利用的终末电子受体。
Fig6. 有氧呼吸对S.Tm中乳酸利用的影响
讨 论
本实验发现了在感染时盲肠中增加的乳酸可以作为一种肠内潜在的营养物。文献表明使用抗生素或诱导肠道黏膜炎症破坏正常状态下肠道中微生物的组成，可以导致微生物代谢物的积累。因此，我们先假设在沙门菌感染时，肠道中增加的乳酸可能是来源于其他微生物。与我们最初假设相反的是，乳酸水平的增加并不主要是由于肠道微生物菌群组成或其代谢的变化。相反，肠道乳酸水平的增加是由宿主代谢引起的（很可能是肠上皮细胞）。然而，在我们的动物模型中，微生物并不是导致乳酸水平增加的直接原因，但是它们提供了丁酸（肠道上皮细胞首选的碳源）。无论是通过使用链霉素，DSS，还是由沙门菌感染引起的肠道紊乱，所导致的产丁酸的梭状芽孢杆菌的耗尽，都足以诱导宿主产生大量乳酸。本研究发现，在沙门菌感染时，丁酸和乳酸的变化与肠道菌群，宿主代谢，和肠道黏膜表面的病原体的代谢相关。
最近的一份研究揭示，肠上皮细胞如何从β-氧化代谢到发酵代谢的转变，并最终导致了氧气从肠组织泄露至肠腔，促进了兼性厌氧的沙门菌的生长。然而在我们发现，沙门菌在利用乳酸时需要一种末端氧化酶（CydAB），说明氧是体内乳酸降解的最终电子受体。呼吸代谢使得沙门菌与其他肠道菌群相比更具有竞争优势。虽然体内L-乳酸代谢需要氧气，但是对于沙门菌来说，只依靠肠道内的氧化作用还不足以利用其他来源（例如肠道中其他微生物）的乳酸，因为服用草酸盐就可以消除乳酸给沙门菌提供的适应性生长优势。我们的研究表明，乳酸脱氢酶和末端氧化酶在疾病条件下形成了一个特有的代谢模式，因此，沙门菌诱导的肠道代谢紊乱，使得肠道上皮细胞既可以产生电子供体也可以产生乳酸氧化的电子受体。
在沙门菌感染期间，伴随着宿主代谢的改变沙门菌的代谢也发生了相应的变化。在沙门菌持续感染时，具有抗炎性的M2巨噬细胞是病原菌复制时的“主要培养基”，尤其是在感染的终末阶段。M2巨噬细胞可以进行脂肪酸氧化代谢，并受RRARγ转录调节因子调控。RRARγ也参与调节肠道上皮细胞的代谢。与近期研究结果一致，我们发现在沙门菌感染时RRARγ的激活，可以降低肠内乳酸的水平。
50年前人们首次发现在肠道炎症时，粪便中有L-型乳酸升高及丁酸的下降。并且在非感染性克罗恩肠炎患者粪便中普遍发现有L-型乳酸的升高，尤其是那些严重的溃疡性结肠炎及病变累积到结肠的克罗恩病患者体内现象最为明显。肠道内乳酸的水平与结肠炎症程度的负相关性与我们的结果一致：炎症导致的体内微生物的失调可以诱导宿主代谢重调（乳酸的产生），并发现这种机制也可以发生在慢性非感染性腹泻患者体内。在炎症性肠炎患者中，我们推测某些疾病与相关的代谢物增加是由于吸收不良或肠道微生物代谢所引起的。相反，在动物沙门菌结肠炎模型中发现乳酸（或可能其他代谢物）的增加事实上是由宿主代谢产生的。总之，我们采用细菌遗传学与靶向（或非靶向）代谢组学相结合的方法，揭示了肠道菌群、宿主、肠道病原菌（沙门菌）之间的代谢关联，并拓展了我们对体内微生物的失调是如何影响组织自稳的认知。
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