硼替佐米的合成及条件优化
硼替佐米 (PS-341) 1 (Fig. 1) 是第一个进入临床的蛋白酶体抑制剂，由Millennium制药公司研发，2003年上市，商品名为万珂®，被美国批准用于治疗复发性多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤。硼替佐米是26S蛋白酶体的可逆性抑制剂，26S蛋白酶体是一种ATP依赖的2.4 MDa多催化作用的蛋白质，位于真核细胞的细胞核和细胞质中，可以降解大量通过泛素途径标记的蛋白质和多肽，参与细胞内稳态和细胞周期调控。硼替佐米中的硼原子能结合26S蛋白酶体的催化位点，抑制蛋白酶体活性，阻断蛋白质水解，从而干扰信号传导，导致细胞死亡。
Figure 1. 硼替佐米的结构
硼替佐米实质是以三聚硼酸酐2的形式存在。在药物冻干的制备过程中，硼氧烷2与辅料甘露醇形成二酯，而该酯在注射用生理盐水溶液中可以重新释放出药物，得到活性硼酸1。
经反合成分析可知，硼替佐米分子由三个结构单元组成：吡嗪酰基、L-苯丙氨酰基和L-硼亮氨酸，它们通过肽键连接在一起。Scheme 1概述了硼替佐米的合成方法，应用手性化合物 (1S,2S,3R,5S)-蒎烷二醇酯合成L-硼亮氨酸单元的对映体。硼酸酯3经CH2Cl2和LDA反应生成的LiCHCl2进行烷基化，生成鎓盐4，该鎓盐在ZnCl2作用下发生选择性重排，生成(1S,2S,3R,5S)-蒎烷二醇 (R)-1-氯-3-甲基丁烷-1-硼酸酯5。这种转化是合成手性α-取代硼酸酯的一种高效方法，称为Matteson重排。下一步在LiHMDS的作用下，中间体5的Cl与LiHMDS的氨基基团进行交换，发生亲核取代反应，同时立体中心反转。如果氨基没有质子化、酰基化或其它衍生化，则α-氨基硼化合物容易自发重排。在TFA作用下，氨基基团被转化为相应的三氟乙酸铵6，TFA重结晶后，以TBTU为缩合剂，手性铵盐6与N-Boc-L-苯丙氨酸缩合，得到Boc保护的二肽7，HCl脱Boc保护得到盐8。后者与吡嗪羧酸缩合，形成硼替佐米的蒎烷二醇酯9。最后，在正己烷和甲醇水的两相溶液中，在强酸性条件下，化合物9与异丁基硼酸发生酯交换，除去和再生蒎烷二醇手性部分，浓缩碱化的有机溶液，重结晶后分离得到硼替佐米的三聚酸酐形式2。
Scheme 1. 硼替佐米的合成
尽管总收率很高(纯物质的38 %)，但合成工艺在合成顺序和基团保护方面还存在一点缺点，增加了反应步数，使整个反应过程变得复杂。在许多情况下，通过合理设计可以部分或完全忽略基团保护，这在复杂分子的合成和规模化生产中尤为有效。为开发一种简便高效的硼替佐米合成方法，设计了一种合成目标化合物的新方法。N-吡嗪酰基-L-苯丙氨酸10和氨基硼酸酯盐4是合成硼替佐米的关键中间体。这两部分进行缩合的潜在困难在于手性N-酰基氨基酸在羧酸活化后容易发生消旋化。为探讨缩合反应中不发生消旋的可行性，先制备两种关键中间体。
吡嗪羧酸与L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐在DPPA作用下发生缩合反应，生成N-吡嗪酰基-L-苯丙氨酸甲酯，TLC进行纯化。将甲酯转化为羧酸10需要额外的水解步骤和分离过程，这促使寻找一个可替代的方法。将L-苯丙氨酸与N,O-双(三甲基硅基)-乙酰胺(BSA)进行简单的N,O-双硅烷化反应，随后用吡嗪羧酸和CDI制备的吡嗪酰基咪唑进行酰化，得到中间体10 (Scheme 2)。在此过程中，羧基以三甲基硅基酯的形式进行硅烷化保护，而苯丙氨酸中保护的硅烷化氨基对酰化剂仍有活性。此外，将两性离子形式的氨基酸转化为可溶于CH2Cl2的衍生物，使反应在均相中进行。经水处理可分离得到纯的产物，且收率较高。
Scheme 2. 硼替佐米的缩合反应
在制备另一关键中间体手性铵盐6时，发现即使重结晶也很难获得合适的纯度，则改进实验方法，将化合物5与LiHMDS反应制得双(三甲基硅基)氨基衍生物11，可经萃取分离纯化。化合物11的1H和11BNMR谱证实，甲基硅烷基团在水中不受影响。在惰性气体保护下，用TFA进行温和酸解，可得到纯盐6，无需额外纯化即可利用。
在CDI作用下，将铵盐6与羧酸10在30 ℃进行缩合，经非手性正相HPLC色谱鉴别，得到45:55的非对映体的混合产物。显然，N-酰基氨基酸10的立体中心在羧基活化后几乎完全消旋。该过程可能是通过噁唑酮中间体进行的，且在极性溶剂和吸电子的N-酰基基团（如吡嗪酰基）时更容易发生(Scheme 3)。
Scheme 3. 经过噁唑酮的消旋机理
实验操作
(1S, 2S, 3R, 5S)-蒎烷二醇 (R)-1-双(三甲基硅基)氨基-3-甲基丁烷-1-硼酸酯 (11)
将n-丁基锂的正己烷溶液(1.6 M，132 mL)于-40 ℃搅拌下加入到六甲基二硅氮烷(41.1 g，255 mmol)的乙醚溶液(160 mL)中，搅拌10 min后，在-25 ~ -30℃间，加入(1S, 2S, 3R, 5S)-蒎烷二醇 (S)-1-氯-3-甲基丁烷-1-硼酸酯5 (53 g，129 mmol) 的乙醚溶液 (180 mL)，45 min加完，反应温度在1 h内升至0 ℃。冰水洗涤反应混合物，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得油状物，35℃真空干燥 (~1×10-2 mmHg)得化合物11(62.98 g，87 %)。
(1S, 2S, 3R, 5S)-蒎二醇 1-铵-3-甲基丁烷-1-硼酸三氟乙酸酯 (6)
双(三甲基硅基)胺11 (10.00 g, 62 mmol)溶于乙醚(90 mL)中，将此乙醚溶液于-15 ~ -10℃在氩气下加入搅拌的三氟乙酸(7.5 mL, 98 mmol)乙醚溶液(100 mL)中，1h内加完。混合液继续搅拌1.5 h，析出沉淀，过滤，乙醚洗涤(50 mL)，35℃真空干燥，得到7.2 g白色结晶盐6 (78 %)，mp 197-198 ℃。该产品在氩气保护下存放在于冰箱中，待下一步使用。
N-吡嗪酰基-L-苯丙氨酸 (10)
将BSA(50.7 g, 250 mmol)加入到L-苯丙氨酸(20.5 g, 125 mmol)的CH2Cl2(200 mL)悬浮液中，得到N,O-双(三甲基硅基)-L-苯丙氨酸溶液，室温搅拌过夜。
吡嗪羧酸(24.0 g, 194 mmol)溶于CH2Cl2(400 mL)形成混悬液，搅拌下将CDI(26.5 g, 250 mmol)加入到此混悬液中，得到吡嗪酰基咪唑溶液，室温搅拌过夜，冷至-30 ~ -40 ℃，然后在30 min内滴加N,O-双(三甲基硅基)-L-苯丙氨酸溶液。在2 h内将温度升至20 ℃，继续搅拌17 h。反应液用柠檬酸水溶液(一水合柠檬酸60 g溶于400 mL水)洗涤，分出水层用CH2Cl2 (100 mL)洗涤，合并有机层，加入乙醚(200 mL)稀释，无水硫酸钠干燥。35 ℃减压蒸去溶剂，得到黄色粉末3.1 g (97 %)，mp 142-146 ℃。
(1S, 2S, 3R, 5S)-蒎烷二醇 N-吡嗪酰基-L-苯丙氨酸-L-硼亮氨酸 (9)
将铵盐6(7.1 g, 18.7 mmol)，N-吡嗪酰基-L-苯丙氨酸10(5.08 g，18.7 mmol)和TBTU(6.62 g, 20.6 mmol)加入CH2Cl2(75 mL)中形成混悬液，搅拌下冷却至-5 ℃。将DIEA(9.5 mL)的CH2Cl2 (35 mL)溶液在2 h内滴加入搅拌的反应混合物中，维持反应温度在-10 ~ -5 ℃。继续搅拌1.5 h，缓慢加热至室温。减压除去溶剂，残余物溶于乙酸乙酯(110 mL)中，依次用水(75 mL)，3 %碳酸钾水溶液(50 mL×3)，水(75 mL)，3 %柠檬酸水溶液(50 mL×3)，水(75mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，残余物溶于乙醚(50 mL)，用硅胶过滤(乙醚100 mL洗涤)过滤，减压蒸去乙醚得到粘稠的油状物8.14 g (84 %)，静置，慢慢结晶，mp 58 -59.5 ℃。
硼替佐米 (2)
硼酸酯9(68 g，13.12 mmol)溶于甲醇 (0.5 L)，搅拌下加入正己烷(0.5 L)和1 N HCl(290 mL)，两相混合物冷却至10 ℃。加入异丁基硼酸(24 g, 235 mmol)，室温搅拌17 h。分离漏斗分离，甲醇层用正己烷(0.1 L×3)洗涤，合并的正己烷溶液浓缩至干。从残留的油状硼酸酯3中经色谱再生得到(1S, 2S, 3R, 5S)-蒎烷二醇手性助剂。甲醇水溶液用NaHCO3(30 g)中和，再用乙酸乙酯(0.85 L)提取，无水硫酸钠干燥，硅胶过滤，乙酸乙酯重结晶两次，得到白色无定形固体26.55 g(26.3 mmol, 60 %)，纯度99.83 %（HPLC）。
—— Tetrahedron 65 (2009) 7105–7108