研究蛋白质相互作用的九种方法,写标书用得上
寒风凛冽,又到了一年一度写标书的季节,你开始准备了么?在分子机制的研究中,蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了,研究蛋白互作的方法有很多,今天我们来介绍九种。
CoIP其实就是两个蛋白相互的IP(免疫沉淀反应)实验,在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下,这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体,可以结合并拉下蛋白B,那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达,反之亦然,通过这种相互间免疫共沉淀的实验,就可以明确地验证出,B与C之间的相互作用了。
比如这份标书:PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究:结合并磷酸化E-cadherin?(百度检索题目可查到全文)
这个实验跟免疫共沉淀实验很像,不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的,在众多的蛋白里,拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了,这还不能证明是直接的结合,很有可能是A 拉住了C,而C拉住了B,这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。要证明直接的结合就是Pull-down实验。提纯所要研究的两个蛋白(一般是在BL21等菌种表达提纯),这两个蛋白带上不同的标签(提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签),然后将他们放在同一个体系里,使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来,用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书:恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。(同样可以百度检索到全文)
将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出,从而可对抗原进行细胞定位。两种不同的蛋白使用不同属性的不同颜色荧光标记后,通过观察颜色的变化确定是否有共定位,也可以使用软件进行分析。应用策略:该技术的主要特点是:特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是:非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂。
比如这份标书:恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。(同上,可以百度检索到全文)
荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠,并且两个分子的距离在10nm范围以内时,就会发生一种非放射性的能量转移,即FRET现象,使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭),而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。
青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein, CFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)为目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFG和受体蛋白YFG分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内,则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收,并激发YFP发出黄色荧光,此时通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近,CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多,检测器所接收到的荧光就越少。
比如这份标书:重大心血管疾病相关GPCR新药物靶点的基础研究(百度可以找到这份标书)
Duolink采用PLA专业技术,通过一抗、二抗、RCA滚环复制来放大荧光信号。proximity ligation assay(邻位连接技术,PLA):一种高灵敏度的蛋白质检测技术。Duolink技术可以得到很高的分辨率和特异性,可以更清晰的、定量的研究蛋白-蛋白相互作用、蛋白的磷酸化水平、蛋白的定量等。这种方法可以检测到较弱的结合,如果上面的几种方法做不出来的话,可以考虑这个方法,不过试剂盒是比较贵的。
目前还没有检索到标书里有写到的,标书里提到的蛋白的相关作用的研究方法以前面四种为主。
这是在活细胞中观察蛋白相互作用的很好的方法。这个方法还是存在假阳性的,细胞里大量表达的分段的YFP可能会不受研究蛋白的结合与否而自己结合在一起,所以阴性对照的使用非常重要。并且YFP两段结合在一起后,基本是不可逆的,小分子或其他抑制剂很难使结合的蛋白分开,在建模的时候要考虑到这个因素。
此方法与BIFC的最大区别在于,BIFC拆分的是YFP荧光蛋白,NanoBiT拆分的是萤光素酶-NanoLuc® Luciferase,由于NanoLuc分子量小,光信号强,表达效率高,非特异性自发光背景低,并且标签蛋白结合是可逆的,所以这个方法较BIFC有很多优势。但是,它需要配对的底物,并且这个底物还不便宜,需要大量使用的话要考虑好经济问题。
这个方法与FRET相比,不需要激发光,背景更低;不需要漂白,细胞损坏更少;同时也避免了自发荧光干扰;作为供体的NanoLuc萤光素酶蛋白分子量小,更适合融合蛋白表达构建,并且光信号强。但是,它需要配对的底物,并且这个底物还不便宜,需要大量使用的话要考虑好经济问题。
SNAP或CLIP的荧光染料标记的底物不能进入细胞,细胞内部不会有信号产生而对实验产生干扰;同时也只能研究蛋白表面的蛋白结合。因为荧光染料是外接的,所以会比内源表达的光强要强。均相检测,可用于高通量筛选。
好了,今天就介绍到这里,对于医生朋友来说,熟练掌握前4种方法,包括原理和protcol,写标书应该够了,如果大家想写后面几种也是可以的,有兴趣的可以了解一下这些方法的原理。
最后祝愿大家,写标书快乐,写标书不开心也是一天,开心也是一点,不如.....不写了吧。