ChIP实验怎么做，要点全在这里
本期主要介绍ChIP实验要点，以及Covaris AFA技术在ChIP实验中的应用与优势。
01
什么是ChIP实验？
染色质免疫沉淀实验（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP), 是研究核酸与蛋白质相互作用的经典实验。DNA分子与目的蛋白分子结合，加入对应抗体识别目的蛋白，进一步把DNA分子共同沉淀下来。下游可通过qPCR技术证明其相互作用，或者通过测序技术寻找目的蛋白的潜在DNA结合序列。
02
ChIP实验主要流程与要点
ChIP实验主要包含四大关键步骤，具体实验细节依据试剂盒类型有所差别，详情参考Covaris官网或对应品牌试剂盒说明书。https://covaris.com/resources/protocols/chromatin-shearing-protocols/
(1) 将细胞或组织进行固定（交联）与裂解
该步骤是在新鲜组织或活细胞中加入甲醛（终浓度1%），目的是稳定蛋白与DNA天然结合的状态，以免后续的实验步骤破坏这种相互作用。在固定完成后，细胞或组织进行充分裂解。
固定时间一般为5-10 min，太长的固定时间将不利于后续的染色质片段化。
强相互作用，如目的蛋白是组蛋白，固定时间应短一些：3-5 min。弱相互作用，尤其是间接相互作用蛋白，可适当延长固定时间，固定时间最长不应超过30 min。
(2) 染色质片段化
该步骤的目的是为了后续能特异检测到染色质上目的蛋白结合的DNA序列。将染色质打断成200-700 bp的小片段，在后续实验中，结合了目的蛋白的片段将被抗体识别而保留，没有结合目的蛋白的小片段则将被洗脱。
在进行后续的实验前，一般会将打断后的样品取一部分进行解交联和DNA纯化，通过琼脂糖电泳或者毛细管电泳检测其片段化范围是否符合下游实验的需求。
(3) 免疫沉淀（IP实验）
此步骤通过目的蛋白的特异抗体，对“DNA-目的蛋白”复合物进行富集与洗脱。后续进行解交联与蛋白消化，最后纯化DNA分子。
IP实验除了有实验组，还应该有阳性对照、阴性对照和空磁珠组，用以质控IP实验流程是否合格。
实验组加入目的蛋白对应的抗体，抗体应该选用IP级别的抗体，WB抗体不一定能满足IP实验，具体参见抗体说明。
阳性对照一般选用已知的组蛋白抗体；阴性对照采用与目的蛋白抗体相同种属来源的血清；空磁珠组则不加任何抗体。
(4) 下游验证（qPCR或ChIP-Seq）
qPCR可以对目的片段进行定量分析。通过对目的序列的扩增，并与Input、阳性对照和阴性对照的量对比，就可以证明目的蛋白是否与预想的DNA序列发生了相互作用。
ChIP-Seq 是将回收纯化的DNA进行建库测序，用于发现目的蛋白潜在结合的DNA序列。
03
Covaris AFA技术在ChIP的作用与优势
Covaris AFA自适应聚焦超声技术，主要应用于染色质片段化的过程中，将染色质剪切成目的大小片段。
Covaris AFA技术在染色质片段化中有以下优点：
高频率短波长，能量集中精准控制，重复性好。
超声过程具备良好等温控制，保护蛋白抗原表位不受热损伤，有利于后续IP实验抗体的识别。
非接触式超声，样品间无较差污染，减少样品损失。
超声过程随机，相比酶切法，无位点偏好性。
毛细管电泳与琼脂糖电泳图皆展示出Covaris良好的重复性，且目的片段集中在200-700bp范围内。
Covraris独有的AFA技术，配套优化的专利耗材，可以保证超声过程中温度恒定，更好的保护生物样品。
04
Covaris ChIP实验相关试剂与耗材
(1) 推荐耗材
一般情况下，ChIP实验推荐使用1mL的milliTUBE。对于微量体积的实验可以考虑用130 μL的microTUBE。
不同耗材的适用细胞用量不同，具体如下
不同耗材在不同型号仪器上采用不同的holder，对应关系如下：
(2) Covaris配套试剂盒
Covaris提供了可用于哺乳动物细胞与组织样品前处理的试剂盒，具体信息如下：
(3) 其它试剂耗材
基因公司代理的CST ChIP试剂盒提供了整套ChIP实验整套试剂，包括样品处理及后续的IP实验及qPCR验证的所需试剂，可以配套与AFA超声共同使用。欢迎有需要的小伙伴联系咨询。
写在文末
实验结果很给力，基因团队暖人心，让我们一起做实验室最靓的仔吧！(●'◡'●)
敬请期待下一期……