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Innate immune activity as a predictor of persistent insulin secretion and association with responsiveness to CTLA4-Ig treatment in recent-onset type 1 diabetes先天性免疫活性可预测胰岛素持续性分泌，和近期发病的1型糖尿病的CTLA4-Ig治疗反应性相关

一.研究背景

  • 1型糖尿病是通过对胰岛B细胞的自身免疫引起的，其主要特征为胰岛抗原特异性自身抗体和自身反应性T细胞的形成。通过混合耐食性测试（MMTT）刺激的C肽测量的胰岛素分泌量会随着时间的推移而减少，同时其下降的速度也不是恒定的，对于年幼的儿童来说，下降的速度更快，能够作为预测发病后病程或预测治疗反应的指标。

  • CTLA4-Ig治疗减缓了患者的B细胞功能的下降，这种作用可能是通过调节记忆CD4+T细胞介导的。

二.分析流程

三.结果解读

1.免疫平衡测量

此前有研究者对1型糖尿病患者（患者组）、没有糖尿病患家族史（对照组）、HLA分型为DR3或DR4的糖尿病患者的抗体阴性的兄弟姐妹（高风险组）和HLA分型为非DR3或DR4的糖尿病患者的抗体阴性的兄弟姐妹（低风险组）4组人群进行了转录分析。并通过确定1374个差异探针开发复合炎症指数，用于定量测量免疫活性，其中评分高偏向炎症状态、评分低偏向调节状态。作者对转录数据进行随机森林分析基于 log2 ratio >|0.263| （1.2倍变化）和FDR <20％重新确定了359个探针。并测定四种人群的这359个探针表达情况，同时将低风险组和糖尿病患者的高表达基因定义为炎症型以及低表达基因定义为调节型，而将高风险组和对照组的高表达基因定义为调节型基因以及低表达基因定义为炎症型（图1a）；并基于这些基因，作者开发了复合炎症指数：103个炎症型探针的平均信号强度除以256个调节型探针的平均信号强度为。同时使用这个复合炎症指数测定四种人群的评分，其中糖尿病患者的复合炎症指数明显高于其他队列（图1b），通过t检验验证糖尿病与其他各组之间的差异（图1c）；最后，作者通过ROC曲线验证构建的由359个探针组成的复合炎症指数（实线）和此前研究的1374个探针模型（虚线）区分糖尿病队列与对照队列的能力，说明作者进一步改进了糖尿病的预测模型，可较好区分出1型糖尿病（图1d）。

图1. 血浆转录特征

2.复合炎症指数与B细胞功能的关系

作者首先探究3、6、12、18、24个月的安慰剂治疗的C肽AUC与复合炎症指数的关系（实线），发现为负相关，随后进一步探究CTLA4-Ig治疗后AUC与复合炎症指数的关系（虚线），发现不呈负相关，与免疫调节改变疾病进程是一致的，同时作者利用这些结果挑选对治疗反应较好的患者作进一步研究。

图2. 复合炎症指数与B细胞功能

作者对复合炎症指数以及MTT刺激的C-肽≥0.2nmol / lin 患者（图3a）和IDAA1c≤9患者（图3b）的部分缓解期的持续时间进行探究，发现均呈负相关。随后，作者依据中位复合炎症指数将糖尿病患者划分为高评分（虚线）和低评分（实线）两组进行K-M生存曲线分析，发现评分高的患者糖尿病缓解比例低，说明炎症程度高的患者缓解的较少（图3cd）。最后作者通过流式细胞仪检测采集发病期的糖尿病患者外周血的T细胞，发现有大量的活化T细胞，证明了假设炎症较高的个体在发作时会经历B细胞功能的加速下降（图3ef）。

图3. 1型糖尿病发作时的炎症水平与发作后部分缓解的持续时间

作者进一步探究年龄与复合炎症指数的关系：2h C肽AUC与年龄显著相关（图4a）；年龄与复合炎症指数无相关性（图4bc）

图4. 复合炎症指数与临床发病年龄之间

3.个体分层有助于确定CTLA4Ig治疗反应的特征

作者选择了反应程度高的八个CTLA4-Ig-治疗者和七个安慰剂治疗者，进行了表达分析，鉴定了1509个差异探针，只有少量与上述的复合炎症指数的探针重复。同时剩下的CTLA4-Ig-治疗者和安慰剂治疗者探针表达量处于反应程度高CTLA4-Ig-组和安慰剂组之间。作者分别对反应程度高的两组以及剩余两组进行聚类，发现反应程度高的可以很好分层；而反应程度低的两组，出现分层效果不完美的状况，说明该组既有进展缓慢或者有治疗无反应的患者（图5a），并使用12个月和24个月各组的表达情况进行验证，发现与前面的类似（图5b）。随后，使用IPA预测1509个探针的候选调节因子，发现TGF-β1、HDAC2、AHR和SREBF1被激活，而KDM5A、CD28和CD3被抑制（图5c）。最后，为了排除由于血液内CTLA4残留导致形成的实验误差，对未经过治疗的患者的血浆加入安慰剂、25μg/ mlCTLA4-Ig和82μg/ mlCTLA4-Ig进行表达分析，发现得到的差异探针与之前实验的探针重复率不高，因此，前面实验得到的是免疫表达的差异而非CTLA4直接作用的结果（图5d）。

图5. CTLA4-Ig治疗反应的特征

4.定义对CTLA4-Ig的反应不同的亚组

为了进一步区分对CTLA4-Ig敏感患者，作者筛选出CTLA4-Ig治疗的患者和安慰剂患者共有的3159个基因（图6a），并对共有的基因进行WGCNA分析，并将其与表型相关联（图6bc），筛选出和 C-肽 AUC 相关的黑色和黄色模块以及与安慰剂和CTLA4-Ig治疗者中C肽下降的速率相关的蓝色模块进行进一步分析，并对这三个模块的916个基因进行了聚类，一共分成4个亚组（图6d）。随后，对916个基因进行了IPA预测上游调节因子并展示它们表达情况，包括：IL-1B、TNF、IFN-γ，其中黑色模块包括促炎因子如：细胞因子（IL1A、IL1B、IL6、）和趋化因子（CCL2、CCL3、CCL4）而蓝色模块包含与IL-10和TGF-β信号传导有关的基因如：SKI、SKIL、INPP5D、SUZ12（图7a），并对这些亚组进一步分析，亚组1的CTLA4Ig治疗者中患者C肽的总体下降率最低，变化最小；亚组2的CTLA4Ig治疗者的C肽下降速度更快。亚组4的安慰剂C肽的总体下降率最高（图7b）。因此， 亚组1和2的患者表现出较低的复合炎症指数评分和较慢的C肽下降速率，亚组3表现出更明显的炎症倾向和更快的C肽下降速率。

图6. WGCNA分析

图7. 亚组分析

最后，基于亚组的复合炎症指数评分与C肽AUC的关系，复合炎症指数与安慰剂治疗的患者中C肽下降的速率之间呈反比。同时，炎症活性较高的患者（第3和第4亚组）表现出了更高CTLA4-敏感性。

图8. 亚组与复合炎症指数与C肽AUC的关系

小结

最后小结一下，作者通过免疫特征来对1型糖尿病进行进一步分型，作者首先筛选出4种人群的差异基因作为探针，进一步构建了复合免疫指数来评分，同时还探究了其与C肽AUC和缓解时间的关系。随后作者进一步挑选对 CTLA4-Ig的反应良好的患者以及同期的安慰剂患者进行了进一步的分析，作者对 CTLA4-Ig治疗以及安慰剂治疗共有的基因进行了WGCNA分析，随后选择3个重要模块的所有基因进行聚类，得到4个亚组，并对它们进行了注释。最后作者结合了复合免疫指数来评分、亚组以及C肽AUC进行了分析

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