【衡道丨笔记】「白求恩·肿瘤病理学社」「肺」常病理时间课程学习笔记（六）
「白求恩·肿瘤病理学社」项目由白求恩公益基金会发起，旨在提升相关疾病病理诊断的规范化，进一步扩大和实现精准治疗前的准确诊断。
今天由上海市肺科医院的谢晓枫老师带来肺癌病理诊断系列课程《「肺」常病理时间》第六讲：《ALK检测技术进展及意义》的配套学习笔记。
上海市肺科医院
住院医师 硕士
谢晓枫
一、 ALK基因研究背景
1. 肺癌的发生与多种驱动基因相关
2019.V3版NCCN指南建议：非小细胞肺癌靶向用药之前检测EGFR、KRAS、HER2、ALK、ROS1、MET、BRAF RET、NTRK（9基因）。
2. ALK基因变异与多种肿瘤相关
ALK是在间变性大细胞淋巴瘤（ALCL)的一个亚型中被发现的，因此定名为间变性淋巴瘤激酶（ALK）；
发现至少20多种EML4-ALK融合变体亚型，其中(E13;A20)和（E6a/b;A20)，这两种类型约占总体的60% ；
ALK除最常见与EML4 融合外，也可以与TFG、KLC1、S0CS5、H1PI、TPR、BIRC6 等基因融合；
研究结果显示,不同的变异亚型可能与抗ALK治疗的PFS相关。
3. ALK基因突变的三种方式
融合突变：ALK最常见的突变，基因融合后所表达出的蛋白表达异常活跃；
点突变：相对少见，主要发生在胞内激酶区，ALK不停地给下游通路传达细胞生长的信号；
扩增突变：也相对少见，通过增加与配体结合进而偶联的机会，提高促进细胞生长的信号。
二、 ALK基因检测
1. ALK检测的临床意义
ALK抑制剂可明显提高ALK阳性晚期非小细胞肺癌患者的客观缓解率，并延长无进展生存时间（PFS）。
2. 2019中国ALK 检测方法指南
NMPA批准了4个技术平台的ALK 基因检测：
ALK Ventana-D5F3 IHC；
ALK-FISH；
RT-PCR；
NGS检测平台。
3. ALK检测方法的局限性与优势
4. ALK检测的标本类型
推荐选择手术切除或活检获取的石蜡包埋的肿瘤组织标本；手术样本保存时间过长（3年以上）、未经过规范化前处理的标本可影响检测结果；
晚期肺癌患者无法获取组织标本时，细胞学样本包括：细胞学穿刺标本或细胞块等经病理学评估肿瘤细胞量满足需要的，推荐用于ALK检测；
对于少数晚期NSCLC患者无法获得组织学或细胞学样本的，专家共识建议尝试使用血液/脑脊液进行ALK检测。
5. ALK检测策略
专家组强烈推荐优先应用 Ventana-D5F3 IHC 进行ALK检测。同时，为了降低样本耗损、加快检测流程，专家组推荐可以将肺癌鉴别诊断免疫组化标志物与ALK D5F3 IHC等同时进行检测；
多基因检测：专家组推荐可以联合FISH和RT-PCR 进行多基因同时检测，或进行 RT-PCR 或NGS检测，实现多个基因组合检测；
当怀疑检测标本有质量问题时，专家组推荐优先应用FISH检测；
临床病理特征可助于检测项目的选择，（ALK基因融合更常见于年轻、非吸烟、富含胞内黏液的实体型肺腺癌患者；男女患者比例相近；且常与其他驱动基因突变如EGFR、KRAS、ROS1等互斥）。
三、 ALK FISH检测技术
1. FISH判读示意图
橘红色与绿色探针相互临近或粘合：ALK 阴性
橘红色与绿色探针相互分离或单个橘红色探针：ALK阳性
单个细胞ALK判读模式图
2. 判读方法
阳性的判读结果定义为单个视野中的50个细胞中至少有25个存在分离信号或绿色信号缺失（50个细胞，50%）；或者两个不同视野中的100个细胞中至少有15个存在分离信号或者绿信号缺失（100个细胞，15%）
3. 判读结果定义
①ALK基因融合阳性：Ratio>50%时，可认为该组织为ALK基因融合阳性；
② ALK基因融合阴性：Ratio<10%时，可认为该组织为ALK基因融合阴性；
③ ALK基因融合结果不确定：Ratio在10%~50%时，需重新选择细胞区域，再计数50个细胞，两次计数结果累加；Ratio<15%时，可认为该组织为ALK基因融合阴性；Ratio≥15%时，可认为该组织为ALK基因融合阳性
4. 不典型病例的定义
单绿信号（5’ALK）或伴扩增等，应定义为不典型病例；
由于EML4-ALK易位是倒置易位，有些病例荧光分离信号距离较近，且断裂点附近不稳定，会产生染色体崩塌导致距离更近，加上立体空间位置，可造成假阴性判读结果；
在试剂盒判读标准中，ALK单绿信号被判为阴性，但有研究显示，部分此类病例经其他技术平台证实存在ALK基因融合表达，且显示出对ALK抑制剂治疗有效；
专家共识推荐，对于FISH信号不典型病例，应推荐其他技术平台进行复检。
5. 判读方式推荐--两步法判读
6. 检测技术--组织处理方法：
7. FISH检测的局限性
结果判读需标准化，必需经过严格培训的病理科医师才能判读；
晚期患者小活检标本很难保证每个视野存在50个癌细胞；
在进行FISH结果判读时，对于分离信号肿瘤细胞比例在临界值附近的病例，判读应谨慎，必要时建议使用其他技术平台进行复检。
四、 ALK IHC检测技术
1. 克隆号选择
专家组强烈推荐优先应用 Ventana-D5F3 IHC 进行 ALK 检测；
其他克隆号：OTI1A4，5A4，1A4，ALK1（仅用于ALK检测结果初筛）。
2. 判读注意事项
ALK Ventana IHC结果判读中存在的一些陷阱，避免假阳性或假阴性；
富含胞内黏液的实体型肺腺癌中易出现ALK融合基因；且由于胞内黏液非特异性吸附，都导致其易被误判为假阳性；
在判读富含黏液分泌的病例时，要格外留意阳性信号的部位及真假；
由于黏液挤压细胞胞质，真实阳性信号易被忽视，而被错判为阴性；
假阳性着色还可出现于：肺泡内巨噬细胞、神经纤维及神经节细胞、呼吸道上皮细胞、坏死组织碎片及细胞外黏液吸附。
3. IHC-D5F3判读质控：
整体染色情况（间质背景是否干净）；
关注亚器官定位，信号位于胞质或者胞质和胞膜（细胞核不应着色）；
染色相对均勻（ALK异质性少见），胞质内的着色也相对均匀；
注意避开腔缘效应以及黏液、坏死等导致的非特异性着色。
4. IHC 检测方法优缺点
优势
（1）无内源性: ALK野生型的NSCLC，ALK蛋白几乎没有内源性表达（避免干扰）；
（2）异质性低：ALK基因融合由于驱动性强，所以在肿瘤组织中异质性低，绝大部分病例蛋白表达均匀一致（易判读）；
（3）ALK基因融合发生频率低：ALK基因融合在NSCLC当中发生频率低，IHC可作初筛；
缺点
（1）发生异位之后的ALK表达强度弱，普通的抗体（ALK1或者ALK-SP8或者5A4等）检测ALK融合蛋白敏感性及特异性均较差；
（2）常规IHC结果不能指导用药。
五、 ALK PCR检测技术
1. 对于检测的样本评估体系
2. 质控关注点
病理质控（是否有肿瘤细胞）；
核酸质控（DNA/RNA质量）；
环境质控（是否有污染）；
操作流程质控（操作是否有问题）。
3. RT-PCR结果判读
在进行RT-PCR结果判读时，对于Ct值在阈值范围附近的病例，判读应谨慎；需结合标本质量、肿瘤细胞含量、质控情况等综合分析；
对结果有疑问时建议使用其他技术平台进行复检；
基于 RT-PCR 检测方法的灵敏度和特异度均较高，但只能检测已知ALK融合基因类型，未知融合不适用此检测，存在假阴性可能；
基于mRNA的PCR扩增， 对于检测环境和标本质量都有比较高的要求，应强化内、外部质控，避免污染。
六、 NGS方法检测ALK
NGS检测流程复杂，影响因素繁多,对实验室要求高。目前能开展此项目的单位非常有限；
在进行NGS检测ALK结果判读时，应充分掌握NGS检测平台及试剂的特点和局限性，结合标本情况、检测质控及测序数据等进行综合判读；
对于质控不合格或结果不典型病例，报告时应加备注，并建议使用其他技术平台进行复检。