ceRNA机制研究案例（三）

在这个风和日丽的日子，我们赛诚又来放干货了，今天我们继续对ceRNA研究进行机制进行深度解读，放出第三篇关于ceRNA机制的文献”LncRNA作为miR-331-3p的海绵吸附体调控HER2的表达”鉴赏。

一、调控通路

当LncRNA HOTAIR低表达时，miR-331-3p与ago2结合到HER2 Mrna的3’-UTR抑制翻译；当LncRNAHOTAIR高表达时，LncRNAHOTAIR竞争性的结合miR-3313p-ago2，使HER2mRNA的翻译不受抑制，从而促进了HER2蛋白的表达。

二、实验流程

本文旨在说明LncRNA HOTAIR结合miR-331-3p后解除其对HER2mRNA翻译的抑制从而促进HER2蛋白表达。作者首先根据临床样本进行Q-PCR检测正常组织细胞核胃癌细胞的LncRNAHOTAIR的表达和存活率与LncRNAHOTAIR表达量关系的分析筛选出本文的主体LncRNAHOTAIR。再进行功能和作用机制两方面的研究。

（1）功能实验：通过建立LncRNAHOTAIR过表达/敲低稳定细胞株，分别进行MTT实验、Hoechst染色、流式细胞仪、Transwell、动物体内成瘤实验验证LncRNAHOTAIR对细胞增殖，细胞凋亡的影响。（2）机制实验：生物信息学分析表明LncRNAHOTAIR有与microRNA的结合位点，作者通过荧光素酶实验验证了LncRNAHOTAIR与miR-331-3p的结合，同样的用荧光素酶实验检测HER23’-UTR与miR-331-3P的关系，然后用Ago2-RIP技术验证了LncRNAHOTAIR与miR-331-3p-Ago2结合。最后通过使用WB检测LncRNAHOTAIR过表达/敲低后的HER2蛋白的表达验证了LncRNAHOTAIR对HER2的促进作用。

三、核心FIGURE

Figure1说明LncRNAHOTAIR以miR-331-3p为靶标来调控HER2的表达。

A、 生物信息学预测LncRNA HOTAIR与microRNA的结合位点。

B、荧光素酶实验，将连接LncRNA的荧光素酶报告质粒与microRNA转染细胞，检测荧光素酶活性，结果表明LncRNAHOTAIR与miR-331-3p的荧光素酶活性显著降低，说明LncRNAHOTAIR与miR-331-3p高度结合。

C、荧光素酶实验，将HER2 3’-utr连到荧光素酶报告质粒上，与LncRNAHOTAIR表达质粒共转染，然后转染miR-331-3p检测荧光素酶活性。表明miR-331-3p抑制荧光素酶活性，HOTAIR促进荧光素酶活性。

D、 Ago2-RIP，用Ago2蛋白抗体钓取与Ago2-结合的RNA，然后通过q-pcr检测表明Ago2结合LncRNAHOTAIR和miR-331-3p。

E、 通过WB检测miR-331-3p过表、HOTAIR敲低和过表达细胞的HER2的表达，说明miR-331-3p抑制HER2表达，而HOTAIR促进HER2的表达。

本公司可提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括q-pcr、WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、luciferase Assay、Ago2-RIP，其中Ago2-RIP、luciferaseAssay为本公司主营项目。

一、luciferaseAssay：检测microRNA与靶标基因3’-UTR的关系。

将HER23’-utr连到荧光素酶报告质粒上，与LncRNAHOTAIR表达质粒共转染，然后转染miR-331-3p检测荧光素酶活性。表明miR-331-3p抑制荧光素酶活性，HOTAIR促进荧光素酶活性。也就是说HOTAIR解除了MiR-331-3p对蛋白表达的抑制。

二、Ago2-RIP：主要研究ago2蛋白与RNA的相互作用

用Ago2蛋白抗体钓取与Ago2结合的RNA，然后通过q-pcr检测，结果表明Ago2结合LncRNAHOTAIR和miR-331-3p。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

参考文献：Xiang-hua Liu, Ming Sun, Feng-qi Nie,et al. Lnc RNAHOTAIR functions as a competingendogenous RNA to regulate HER2 expressionbysponging mi R-331-3p in gastric cancer. Molecular Cancer,2014,13:92